Chapter 4. Effect of Salicylic Acid and Calcium Chloride to Heat Tolerance of Poinsettia
摘要(Abstract)
聖誕紅(Euphorbia pulcherrima Willd.)在臺灣夏季栽培時易發生插穗產量減少、
植株生長停滯、盲芽、停心及狹葉化等生理障礙。水楊酸(salicylic acid, SA)和氯化 鈣(calcium chloride, CaCl2)具有提升作物耐熱性之效果。本研究藉由施用 SA 和 CaCl2改善聖誕紅之高溫耐受性，探討SA 和 CaCl2之施用濃度和比例以及施用方 式對聖誕紅耐熱性提升之影響。試驗以聖誕紅‘Winter Rose’、‘Noel ’ 、‘Ice Punch’
扦插6 週苗為材料，試驗分為去離子水(對照組)、10 mM CaCl2、200 μM SA 、400 μM SA 、10 mM CaCl2 + 200 μΜ SA、10 mM CaCl2 + 400 μM SA 等 6 種處理，植 株噴施藥劑5 小時後放置於 42℃生長箱 50 分鐘，隨後取出植株進行各項調查。結 果顯示各藥劑處理皆可提升葉綠素螢光值、降低葉片相對傷害值和葉片溫度，並提 升側芽萌發率、新葉數和外觀品質。最適濃度方面，‘Winter Rose’為 400 μΜ SA + 10 mM CaCl2最佳；‘Noel ’各藥劑處理間無顯著差異；‘Ice Punch’則以 200 μΜ SA +10 mM CaCl2最佳。噴施或澆灌SA 和 CaCl2複合藥劑皆可提升聖誕紅之耐熱性，
兩種處理方式之間沒有顯著差異。施用200 μM SA + 10 mM CaCl2可顯著降低‘Noel’
高溫逆境後之丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，並提升過氧化氫酶(catalase, CAT)之活性。總結來說，施用 SA 和 CaCl2藥劑可提升聖誕紅各項耐熱生理指標，
唯複合施用更能提升外觀等級，最適濃度依品種而異。
一、 前言(Introduction)
聖誕紅( Euphorbia pulcherrima Willd.)之生長適溫為日溫 24-28℃，夜溫 21-23℃，
在高溫逆境下聖誕紅易發生插穗產量減少、植株生長停滯、盲芽、停心及狹葉化等 生理障礙(楊，2015)。
施用化學藥劑水楊酸(salicylic acid, SA)和氯化鈣(calcium chloride, CaCl2)能提 升作物之耐熱性，在抗氧化系統中，鈣離子具有訊息傳遞、增加抗氧化酵素活性及 調節氣孔開閉等功能。SA 則有訊息傳導、維持鈣離子平衡、促進抗逆境蛋白質產 生、減少過氧化物等功能，因此施用 SA 和 CaCl2可提升作物的耐熱性(Jiang and Huang, 2001)。
施用CaCl2可提升兩種溫帶草於高溫下栽培的外觀品質、相對含水量、葉綠素 含量及抗氧化酵素的活性，並降低丙二醛(malondialehyde，MDA)含量(Jiang et al., 2001)。100 μM SA 可減少四季秋海棠葉片相對傷害值(relative injury, RI)、降低 MDA 含量、增加株高及花朵數；施用方式以澆灌較噴施更有效，澆灌100 μM 可以降低 Fv/Fm，且得到較佳的外觀品質 (Lin et al., 2011)。澆灌 100 μM SA 和 5 mM CaCl2
複合藥劑可提升鳳梨鼠尾草於高溫下之葉綠素計讀值(SPAD-value)、Fv/Fm，降低 RI 值，且提升外觀等級，施用複合藥劑的效果較單獨施用 SA 或 CaCl2更佳(林，
2016)。
目前仍尚未有利用水楊酸和氯化鈣複合藥劑提升聖誕紅耐熱性之前人研究，
本研究藉由施用SA 和 CaCl2改善聖誕紅之高溫耐受性，探討SA 和 CaCl2之施用 濃度和比例以及施用方式對聖誕紅耐熱性提升之影響。
二、 材料與方法(Materials and Methods)
試驗一、水楊酸和氯化鈣複合藥劑對聖誕紅高溫下生理和生長之影響 (一)植物材料
於 2017 年 6 月自桃園市復興區莊姓業者購買聖誕紅‘聖誕玫瑰’(‘Winter Rose’)、
‘聖誕節’(‘Noel ’ )、‘冰火’ (‘Ice Punch’)扦插 3 週之 9 cm 盆幼苗，栽培於臺灣大學 芳蘭路園藝分場環控溫室中 3 週(日均溫 30.4℃，日間平均最大光度 700-1800 μmol·m-2·s-1)，每週施用 1 次 20N-8.8P-16.6K (Peters 20-20-20, Scotts, Marysville, Ohio)1000 mg·L-1，每2 週施用一次 Johnson’s solution 微量元素。待所有品種之新 生側枝達7 個節位時，移至 32/28℃，日長 14 小時，光強度:180 μmol·m-2·s-1 之生 長箱馴化 1 週。試驗時間自 2017 年 6 月 20 日至 2017 年 8 月 30 日。氣象資料以 氣 候 蒐 集 記 錄 儀 HOBO data logger(HOBO UA-002-64, Onset, Cape Cod, Massachusetts)紀錄。
(二)試驗處理
將植株噴施藥劑，5 小時後放置於 42℃生長箱 50 分鐘，之後每天調查 1 次。
噴施藥劑共6 種處理，每處理 5 重複，6 種處理分別為：去離子水(對照組)、10 mM CaCl2、200 μM SA 、400 μM SA、10 mM CaCl2 +200 μΜ SA、10 mM CaCl2 + 400 μΜ SA。
(三)調查項目：
1. 相對傷害值(relative injury, RI)
測定方式參考 Onwueme(1979)和吳(2015)，選取自莖頂向下之第 1 片完全展 開葉，以直徑 0.9 cm 之打孔器剪取葉圓片，經一次蒸餾水漂洗後，每 5 片葉圓片 放入裝有 15 mL 一次蒸餾水之試管，每試管 1 重複，共 5 重複。利用恆溫水浴
槽(water bath G-20, Kingtech Scientific Co., Ltd. Taiwan.)以 55℃處理 15 分鐘，隨 後置於6 ± 1℃之黑暗環境下 24 小時後取出，以電導度計(SC-170, Suntex, Taiwan) 測定，此值定義為R1；再將葉片組織於殺菌釜內高溫高壓(121℃, 20 分鐘)完全破 壞，待冷卻後，測得最後之 EC 值為 R2，再代入公式中求出相對傷害值(Relative injury；RI)。計算公式為： RI (%) = ( R1 / R2 ) ×100%
2. 葉綠素螢光值(chlorophyll fluorescence)
於高溫處理前以及處理後第0、1、3、5 天利用葉綠素螢光測定儀(Mini-Pam, Walz Co., Germany)量測葉綠素螢光值，調查參數為 Y(Ⅱ)和 Fv/Fm。於光照下可測 得Y(Ⅱ)，代表最大光化學量子效率；葉片經 30 分鐘暗適應可測得 Fv/Fm，代表最 大 PSⅡ的光能轉換效率(Baker and Rosenqvist, 2004)。
3. 新葉數：藥劑處理 2 週後調查植株之新葉數目，新葉定義為新生未完全展開之 葉片。
4. 側芽萌發率：藥劑處理 2 週後調查植株之總芽數和側芽萌發數，相除後計算側 芽萌發率。
5. 外觀等級評分：藥劑處理 2 週後調查外觀等級評分，共分為 1-5 分，評分標準 如下：
5 分: 受害葉片數小於 1 片。
4 分: 受害葉片數 1-2 片。
3 分: 受害葉片數 3-4 片。
2 分: 受害葉片數 5-6 片。
1 分: 受害葉片數大於 6 片。
受害葉片: 包含高溫處理後落葉、黃化或焦枯的葉片。
(四) 統計分析
試 驗 採 完 全 逢 機 設 計(complete randomized design, CRD) 。 數 據 以 Costat 6.4(CoHort software, Monterey, CA, USA)統計軟體整理，以最小顯著差異(least significant difference, LSD)分析處理間差異(P ≤ 0.05)，繪圖採用 Sigma Plot 10.0 軟 體 (Systat software INC., Richmond, CA, USA)。
試驗二、澆灌或噴施複合藥劑對聖誕紅耐熱性之影響 (一)植物材料
同試驗一。
(二)試驗處理
試驗共3 種處理，每處理 5 重複，3 種處理如下：
1. 對照組：澆灌二次水 50 ml，並且噴施二次水於全株葉片表面；
2. 澆灌(drench)藥劑：澆灌複合藥劑(10 mM CaCl2 + 200 μM SA ) 50 ml 並且噴施二 次水於全株葉片表面；
3. 噴施(spray)藥劑：噴複合藥劑(10 mM CaCl2 + 200 μM SA )於全株葉片表面並且 澆灌二次水50 ml。
藥劑處理5 小時後將植株放置於 42℃生長箱 60 分鐘，之後進行各項調查。
(三)調查項目：
1. 相對傷害值(relative injury, RI)
測定方式參考 Onwueme(1979)和吳(2015)，選取自莖頂向下之第 1 片完全展 開葉，以直徑 0.9 cm 之打孔器剪取葉圓片，經一次蒸餾水漂洗後，每 5 片葉圓片 放入裝有 15 mL 一次蒸餾水之試管，每試管 1 重複，共 5 重複。利用恆溫水浴 槽(water bath G-20, Kingtech Scientific Co., Ltd. Taiwan.)以 55℃處理 15 分鐘，隨 後置於6 ± 1℃之黑暗環境下 24 小時後取出，以電導度計(SC-170, Suntex, Taiwan) 測定，此值定義為R1；再將葉片組織於殺菌釜內高溫高壓(121℃, 20 分鐘)完全破 壞，待冷卻後，測得最後之 EC 值為 R2，再代入公式中求出相對傷害值(Relative injury；RI)。 計算公式為：RI (%) = ( R1 / R2 ) ×100%
2. 葉片溫度
植株置於 32/28℃，日長 14 小時，光強度:200 μmol·m-2·s-1 之生長箱中，並以 保麗龍板調整植株高度，使所有植株高度一致。40 分鐘後以紅外線熱像儀(TVS-200EX, Nippon Avionics, Tokyo, Japan)拍攝第一片成熟葉片之熱影像並進行分析，
測量單位為℃。
3. 葉綠素螢光值(chlorophyll fluorescence)
於高溫處理前及處理後第0、1、2、4、6 天利用葉綠素螢光測定儀(Mini-Pam, Walz Co., Germany)量測葉綠素螢光值，調查參數為 Y(Ⅱ)和 Fv/Fm。於光照下可測 得Y(Ⅱ)，代表最大光化學量子效率；葉片經 30 分鐘暗適應可測得 Fv/Fm，代表最 大 PSⅡ的光能轉換效率(Baker and Rosenqvist, 2004)。
(四) 統計分析 同試驗一。
試驗三、水楊酸和氯化鈣複合藥劑對聖誕紅抗氧化酵素系統之影響
(一)植物材料
將聖誕紅‘Noel ’扦插 3 週之 9 cm 盆幼苗，栽培於臺灣大學芳蘭路園藝分場環 控溫室中 3 週(日均溫 26.8℃，日間平均最大光度 600-1400 μmol·m-2·s-1)，每週施 用 1 次 20N-8.8P-16.6K (Peters 20-20-20, Scotts, Marysville, Ohio)1000 mg·L-1，每 2 週施用一次 Johnson’s solution 微量元素。待所有品種之新生側枝達 7 個節位時，
移至日/夜溫 32/28℃，日長 14 小時，光強度為 180 μmol·m-2·s-1 之生長箱馴化 1 週。試驗時間自2018 年 4 月 20 日至 2018 年 5 月 20 日。氣象資料以氣候蒐集 記錄儀 HOBO data logger(HOBO UA-002-64, Onset, Cape Cod, Massachusetts)紀錄。
(二)試驗處理
試驗分為 2 種處理，將植株分別噴施去離子水(對照組)和 200 μM SA + CaCl210 mM，5 小時後放置於 42℃生長箱 50 分鐘，24 小時後取樣進行丙二醛和 抗氧化酵素之分析。每處理3 重複，1 植株為 1 重複。
(三)調查項目
1. 丙二醛(malondialdehyde；MDA)含量
測定方式參照Heath 和 Packer(1968)，取熱處理後之葉片 90~100 mg，加入 4 mL 5% TCA(trichloroacetic acid)研磨，之後以 20℃，10000 g 離心 5 分鐘，取 1 mL 上清液加入4 mL TBA(thiobarbituric acid；將 0.5% TBA 溶於 20% TCA 中)，以 95℃
熱水浴 30 分鐘，再將加熱後之試管迅速插入冰中以終止反應，利用超音波震盪 15 分 鐘 去 除 氣 泡 ， 轉 速 3000 g 離 心 10 分 鐘 ， 最 後 以 分 光 光 度 計 (U2800A Spectrophotometer, Hitachi, Japan)測定萃取後溶液在 A532 及 A600 之吸光值，MDA 含量計算方式如下：
MDA(nmol·g-1) = (A532-A600) ÷ 155(K，mM-1·cm-1) × 5(反應體積) × 4(稀釋倍 數) × 1000 ÷ FW(g)
2. 過氧化氫酶(catalase, CAT)活性
測定方式參照 Hwang and VanToai(1991)，取 0.2 g 的樣品加入 1ml sodium phosphate buffer(50mM, pH=6.8 )，以 4℃轉速 12000g 離心 20 分鐘，離心完迅速將 上清液移至新的離心管，並放入冰中保持低溫測量 Catalase 活性。取 200μL 萃取 液石英管 + 2.7 mL sodium phosphate buffer(100mM, pH=7.0) + 0.1mL H2O2(1M, 新 鮮 配 製) ， 所 有 藥 物 加 完 後 ， 加 蓋 混 合 均 勻 ， 置 入 分 光 光 度 計 (U2800A Spectrophotometer, Hitachi, Japan)測量一次，測 A240 1 分鐘後，再測量一次 A240。
CAT 活性計算方式如下：
CAT activity (Units g-1) =
△A240 ÷ 40(反應係數) × 3(反應體積) × 5(稀釋倍數) ÷ 1(min) ÷ FW(g) 1Unit = 1nmol H2O2 consumed min-1
3. 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性
測定方式參照Paoletti等(1981)，取0.5 g樣品，加入3 mL sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.4)混合震盪，以4℃轉速15000 g 離心3分鐘，取0.2 mL上清液，分別 加入0.08 mL NADH (7.5 mM, 新鮮配製)、1.6 mL Tea-Dea buffer (triethanolamine-diethanolamine, 100 mM, pH 7.4)、0.05 mL EDTA/MnCl2 (100 mM/50 mM, pH 7.0)、
1 mL 2-Mercaptoethanol (10 mM, 啟動反應)。藥品混合後，立即置於石英管中，以 分光光度計(U2800A Spectrophotometer, Hitachi, Japan)偵測波長 340nm 之吸光值 10 分鐘，blank以0.2 mL sodium phosphate buffer 取代酵素萃取液。SOD活性計算 方式如下：
SOD activity (Unit g-1) = (空白組 ΔA340 － 樣品之 ΔA340)
空白組之 ΔA340 × 100% ÷ 50% x 15 (稀釋
倍數) ÷ 10 (min) ÷ FW (g)
1 Unit 定義為 SOD 抑制 50％ NADH 每分鐘之氧化速率
(四)統計分析
試驗採完全逢機設計(complete randomized design, CRD)。數據以 Costat 6.4(CoHort software, Monterey, CA, USA)統計軟體進行 t-test 分析(P ≤ 0.05)，繪圖採用 Sigma Plot 10.0 軟體 (Systat software INC., Richmond, CA, USA)。
三、結果(Results)
試驗一、水楊酸和氯化鈣複合藥劑對聖誕紅高溫下生理和生長之影響
在耐熱生理指標方面，所有藥劑處理皆可恢復‘Winter Rose’之 Fv/Fm 至 0.7 以上，處理間差異不顯著；200 μM SA + 10 mM CaCl2 、400 μM SA + 10 mM CaCl2、 10 mM CaCl2 及 400 μM SA 等 4 種處理可恢復‘Ice Punch’之 Fv/Fm 至 0.7 以上，但 4 種處理間差異不顯著；對‘Noel’之葉綠素螢光值則無顯著影響(圖 4.1、圖 4.2)。‘Winter Rose’對照組 RI 值 31.81%，藥劑處理可使 RI 值降低至 30%
以下其中400 μM SA + CaCl2 10 mM 處理之 RI 值最低(21.39%)；‘Noel’對照組 RI 值16.68%，藥劑處理可使 RI 值降低至 16%以下，其中 200 μM SA + CaCl2 10 mM (12.97%)、400 μM SA + 10 mM CaCl2 (12.84%)及 10 mM CaCl2 (11.68%)三種 處理之RI 值最低；‘Ice Punch’對照組之 RI 值 34.13%，藥劑處理可顯著降低 RI 值至25%以下，處理間無顯著差異(圖 4.3)。
在植株生長表現方面，經藥劑處理有較高的側芽萌發率，其中以 200 μM SA + 10 mM CaCl2和10 mM CaCl2最有效，可提高至80%以上；‘Ice Punch’經藥劑處 理有較高的側芽萌發率，其中以200 μM SA + 10 mM CaCl2 、400 μM SA + 10 mM CaCl2及400 μM SA 最有效，可提高至 70%以上；對‘Noel’側芽萌發率則無顯著差 異(圖 4.4)。藥劑處理可提升‘Winter Rose’之新葉數，其中 400 μM SA + 10 mM CaCl2
和10 mM CaCl2和10 mM CaCl2最有效(皆 24.33 片)；‘Ice Punch’經藥劑處理有較 高的新葉數(超過 30 片)，但處理間差異不顯著；對‘Noel’之新葉數則無顯著影響(圖
和10 mM CaCl2和10 mM CaCl2最有效(皆 24.33 片)；‘Ice Punch’經藥劑處理有較 高的新葉數(超過 30 片)，但處理間差異不顯著；對‘Noel’之新葉數則無顯著影響(圖