4-1 藥劑 Reagent
(1) MG-63 購自 ATCC (American Type Culture Collection, USA)。
(2) 丁酸購自 Sigma (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA)。
(3) 培養液為 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)，fetal bovine serum (FBS)， Penicillin/streptomycin 購自 Gibco (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)。
(4) The SuperScript TM III First-Strand DNA synthesis system for RT-PCR 購自 Invitrogen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)。
(5) RNA isolation kit and NucleoSpin RNAII 購自 Macherey-Nagel (Macherey-Nagel Inc., Easton, PA, USA)。
(6) 細胞溶解液(lysis buffer)的成份如下：10 mM Tris (pH=7.0)，140 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.5% NP-40，2 mM PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride)，1%
aprotinin，5 mM DTT (dithiothreitol)。.
(7) RNaseA for flowcytometry 購自 Becton-Dickinson (San Jose, CA, USA)。
(8) Propidium iodide (PI，ICN) for flowcytometry 購自 Sigma (Sigma Chemical Company, St Louis, MO, USA)。
(9) Blocking buffer for western blotting 的成份如下：25 g 脫脂奶粉，0.1g NaN3， 加入 1X TBST 至 500 mL，保存於 4˚C 的環境中。
(10) 細胞溶解液(Golden lysis buffer) for western blotting 的成份如下: 137 mM NaCl，20 mM Tris (pH= 7.9) ，10 mM NaF，5 mM EDTA，1 mM EGTA，10%(v/v) Glycerol，1%(v/v) Triton X-100，1 mM Sodium orthovanadate，1 mM Sodium pyrophosphate，100 mM β-Glycerophosphate，加入 ddH2O 至 500 mL，保存於
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4˚C 的環境中。
(11) Protein Extraction Buffer (1mL) for western blotting 的成份如下:0.955 mL Gold lysis buffer，20 μL PMSF(50 mM)，10 μL Aprotinin (1 mg/mL)，10 μL
Leupeptin(1 mg/mL)，5 μL DTT (1 M)。
4-2 培養 MG-63 細胞
(1) 將MG-63細胞培養在10 cm dish中 (Corning Industries, Corning, NY)。
(2) 於相位差顯微鏡 (IX-71, Olympus INC.,USA)於100倍下觀察長到7-8分滿可分 盤去除上清液，利用PBS wash(5 mL/dish)，接著吸除PBS，加入1倍的trypsin/
EDTA (1 mL/dish) 。
(3) 放入於37 ˚C，5%二氧化碳(CO2)，潮濕環境的培養箱中置放5分鐘。
(4) 取出培養皿後，輕拍以拍下仍附著的細胞後，加入4 mL的medium(含10%
DMEM)，以1:4的比例，混和均勻後分盤(4盤)。
4-3 藥物對 MG-63 細胞型態影響(cell morphology)
(1) 在 6-well culture plate 的每格中舖上 5x105個 MG-63 細胞於含 10%FBS 的
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(8) 使用 ELISA reader (Multiskan Spectrum, USA) ，於 540 nm 波長下測量其 OD 值。
4-5 反轉錄聚合酶連鎖反應
(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) (RT-PCR)
此方法用來評估細胞週期相關的調控基因的表現。使用 primer 如下:
Primer Sense sequence Anti-sense sequence Base
pair β-actin 5'-AGAGGCATCCTCACCCT-3' 5'-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3' 218 bp
(ref: Wang et al.,2000)
19 Cdc25c 5' CCTGGTGAGCCTTCGAAGACC 3' 5'-
GCAGATGAAGTACACATTGCATC -3'
456bp
(ref: Martignoni et al., 2003)
Cyclin-B1 5'-
(ref: Krause er al.,2000)
4-5-1 分離抽取 MG-63 細胞的 RNA：
(1) 將培養接近長滿的 MG-63 細胞培養液抽吸掉，換成新鮮的培養液之後加入不 同濃度丁酸 (0 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM, 16 mM)，處理時間為 24 小 時。
(2) 吸除培養液後，以磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate-buffered saline; PBS)清洗後，加 入 350 μL RAI (lysis buffer，guanidine thiocyanate)和 3.5 μL β-mercaptoethano 到培養盤中，用無菌刮勺將細胞刮下，將黏稠液吸至 NecleoSpin Filter unit (Macherey-Nagel INC., Germany)，放到紫色收集管(filtration column)中，以 14000 r.p.m. (Z 233 MK-2, HermLe INC., Germany)離心 1 分鐘，收取濾液。目 的是將蛋白質，細胞壁等阻擋在膜上，收集濾液 cell lysate。
(3) 在濾液中加入 350 μL 70%酒精，並用 pipette 混合使得濾液均質化。
(4) 組合 NecleoSpin RNA column 和 2mL 的離心管，將濾液吸入容器(column)上 層中，以 10000 r.p.m.離心 30 秒，去除液體。
(5) 組合 NecleoSpin column 放入一個新的無菌收集管中(Silica column)，加入 350 μL 的 MDB (Membrane Desalting Buffer，guanidine thiocyanate<10%)， 以 14000 r.p.m.離心 1 分鐘，去除液體。
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(6) 準備 DNase reaction mixture：以 10 μL DNase 加入 90 μL DNase reaction buffer 混合。
(7) 將 95 μL DNase reaction mixture 放入結合 NecleoSpin RNA column 之離心管中，
靜置使其反應 15 分鐘。
(8) 加入 200 μL RA2 (DNase stop solution 和 wash buffer，guanidine thiocyanate) 到 NecleoSpin column，以 10000 r.p.m.離心 30 秒，去除液體。
(9) 加入 600 μL RA3 (wash buffer)到 NecleoSpin column，以 10000 r.p.m.離心 30 秒後去除上清液。
(10) 倒掉濾液，再加入 250μL RA3(wash buffer)到 NecleoSpin column 以 14000 r.p.m.離心 2 分鐘，再將 column 放到 1.5 mL nuclease-free 的離心管中。
(4) 將 RNA+DEPC-treated H2O 的溶液以分光光度計(Spectrophotometer, Hitichi, U-2001)，測出 RNA 在 280 nm 和 260 nm 的吸光值。
(5) 將 280 nm 和 260 nm 的數值輸入電腦，跑出經定量後的 RNA 和 DEPC-treated H2O 數值(λ)。
(6) 所抽到的 RNA 濃度(μg/mL)為：OD 260 x 40 x 稀釋倍數(μg) (即 1 mL 的 DEPC- treated H2O/加入 10 μL RNA；若 260 nm 的 OD 值為 1，則表示 1 mL RNA 溶
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液 含有 40 μg 的 RNA。(將抽到的 RNA 測量其 260nm/280nm；若比值大於 1.8 表示所抽到的 RNA 純度夠)
4-5-3 反轉錄(Reverse Transcription，RT) :
使用的是Invitrogen SuperScript○RⅢ First-Strand Synthesis System (adapted from Life Technologies Corporation)。
(1) 在 0.2 mL eppendorf 中配製 RNA/primer mixture，配法如下：5 μg RNA 1-8μL (<8μL)，1 μL dNTP 10mM，Oligo (dT)(0.5 μg/μL)， 加入 DEPC-treated water 至 總體積 10 μL。
4-5-4 聚合酶連鎖反應 Polymerase Chain Reaction (PCR) :
(1) 於總體積 50 μL 的混合反應液中分別含有 2 μL 的 first-stand cDNA，5 μL 的 10 倍 PCR buffer，2 單位 Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA)，1 μL 各種 欲測定之 primer，200 μmol 的 deoxynucleotide triphosphate (dNTP)。混合均勻
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後置入溫度循環器(Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 thermal cycler, using the GenePrint STR System LPL (8p22) of Promega Corporation, Madison, WI, USA.)。
(2) 聚合酶連鎖反應的溫度先以94˚C，2 分鐘來分開雙股(denaturation)，而後為 20-35 個溫度循環反應，其中每個循環依序為: 下觀察，並以 Alpha Image (Alpha Innotech Corporation#210125)照相記錄。
4-6.西方點墨法(Western Blot)
eppendorf tube 中，使用震盪器 (Vortex Genie2, Scientific Industries Inc., USA)23
震盪之，然後置於冰浴 20 分鐘，每 10 分鐘震盪一次。
(4) 以 12000 r.p.m.(Z 233 MK-2, HermLe INC., Germany) 離心 30 分鐘，並以 BSA 蛋白質濃度測定試劑組(Amresco Inc. , USA)來測量上層 cell lysate 中蛋白質濃 度。
(5) 以每管含 45 μg 蛋白質的濃度分裝至 eppendorf tube 中，保存於 -20℃環境 中。
4-6-2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE): 分析蛋白質
(1) 製膠的配方：
★10%分離膠 (resolving gel)
成分 體積
去離子水(ddH2O)
1.5 M pH6.8 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液 Tris(hydroxymethyl)aminomethane; Tris-HCl 40% 丙烯醯胺 (Acrylamide)
10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS 10% 過硫酸銨 (Ammonium persulfate; APS)
四甲基乙二胺 (Tetramethylethylenediamine; TEMED)
3.05 mL
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成分 體積
去離子水(ddH2O)
1.5M pH6.8 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝液 Tris(hydroxymethyl)aminomethane; Tris-HCl 40% 丙烯醯胺 (Acrylamide)
10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS 10% 過硫酸銨 (Ammonium persulfate; APS)
四甲基乙二胺 (Tetramethylethylenediamine; TEMED)
2.8 mL
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS 10% 過硫酸銨 (Ammonium persulfate; APS)
四甲基乙二胺 (Tetramethylethylenediamine; TEMED)
1.574 mL
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(2) 製膠方法:
將電泳片裝置在電泳槽(BioRad)上(電泳片上層為 stacking gel，下層為 resolving gel)，在電泳膠片製作完成後，並填滿電泳緩衝液。將分裝於 0.5 mL eppendorf tube 的蛋白質樣本加入 3 μL 的 SDS/protein loading dye，使用乾浴器 (Fire Fox Dry Bath 6100, 汎泰)於 100℃環境加熱 5 分鐘後，再以冰浴冷卻。將所 處理之蛋白質樣本置入各個 well 中，以 80-120 mA 的電流量進行電泳分離，經 過適當時間後停止電泳。
4-6-3 蛋白質樣本的轉印
(1) 試劑與材料
i. 電泳轉印槽(electrotransfer tank; SCIE-PLAS , UK) ii. 電源供應器(PowerPac Basic; Biorad, USA) iii. 轉漬紙(3M paper)
iv. 電泳轉印緩衝液(electrotransfer buffer)
v. 轉漬膜(Hybond-PVDF transfer membrane; Perkin Elmer, Canada) (2) 方法：
剪一張 Hybond-PVDF transfer membrane，先以甲醇(methanol)浸濕活化 1 分鐘以去除其極性，再用水將 membrane 洗浸，連同兩張 3M paper 放入 transfer buffer(內含 20 mM Tris-HCl, 150mM Glycine, 20% Methanol, pH=8.3)中浸濕。
操作時，堆疊的順序由下而上依次為 3M paper、Hybond-PVDF transfer membrane、SDS-PAGE gel、3M paper，並使用玻璃棒去除在其中的氣泡，
再放入轉漬槽中，以 400 mA 的電流量轉漬 90 分鐘。
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4-6-4 免疫墨點法 ( immune-blot )
(1) 轉印完成後，PVDF transfer membrane 以 5% milk blocking buffer(含 5%牛奶的 TBST)作用 30 分鐘。
(2) 將前述之牛奶液置換為與細胞週期相關之初級抗體(primary antibody) ; 於室 溫下作用兩小時(兼震盪之)。
(3) 以 TBST (Tris-base 0.607g、 NaCl 2.92g、TWeen 20 0.5mL 加二次水至 500 mL，
pH 7.5)緩衝液清洗三次，每次五分鐘。
(4) 加入與初級抗體對應之 1:5000 的二級抗體(HRP-labeled anti-goat、anti-mouse、
anti-rabbit secondary antibody)，室溫下作用一小時(兼震盪之)。
(5) 以 TBST 緩衝液清洗三次，每次五分鐘。最後加入 Luminol 感應試劑(enhanced chemiluminescence reagents；Santa cruz Bioetechnology, USA)作用 40 秒。
(6) 在呈色機(LAS-4000, Fujifilm, Japan)上以適當時間顯影。
4-7 利用流式細胞儀(Flow Cytometer)分析細胞週期變化
4-7-1 細胞收取與固定
MG-63 細胞 ( 5X105 ) 在 6-well culture plate 中以含 10% FBS 之 DMEM 培養 液中培養 24 小時，待細胞貼附於盤底後，置換新的 DMEM 培養液。接著依實 驗設計的不同，加入的作用藥物濃度與作用時間點如下: 以不同濃度的丁酸 (NC, 1 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM, 16 mM)作用於 MG-63 細胞 2/6/24/48 小時。待作用時 間終了，將培養液收取，並加入 0.05% trypsin-0.02% EDTA solution(Sigma Biotechnology Inc., USA)，待靜置作用 5 分鐘後，收下細胞至 15mL 離心管中，
27 (5 mL Polystyrene Round-Buttom Tube; BD Falcon, USA)中，加入 250 μL 的 staining buffer (碘化丙啶 Propidium Iodide, 0.04 mg/mL)，以及 2 μL 的 RNaseA (1%)，並 在暗室反應 15 分鐘。
4-7-3 上機
於流式細胞儀(FACS Calibur，Becton Dickinson，CA，USA)上以CELLQuest 軟體(Becton Dickinson)做細胞週期分析，分析時以FL2 channel讀取PI的螢光 (argon laser at 488 nm wavelength excitation and a 610-nm filter)，收取的細胞數為 1X105個細胞，並以Modfit LT version2.0軟體(Verity Software House，Inc.，USA) 計算細胞週期的比率。
4-8. 利用 DCF 染色來判定細胞內的活性氧族群
主要是利用可以自由通過細胞膜的染劑 2',7'-dihydrodichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) (Sigma Biotechnology Inc., USA)，通過細胞膜後經過去酯化 (deesterified)後變成 Dihydrodichlorofluorescein (DCFH)，而 DCFH 與氧自由基 reactive oxygen species (ROS)作用後能夠成為具有螢光的 DCF，所以 DCF 染色被 認為可以用來偵測細胞內氧自由基的改變(Karlsson et al., 2010)。步驟如下:
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4-9 電子顯微鏡(Scanning electron microscope, SEM) 觀察細胞型態
4-9-1 緩衝液 ( buffer ) 配製
所使用緩衝液種類為 0.2 M cacodylate buffer，使用 4.28 g 的二甲次酸鈉 (Sodium Cacodylate，Na(CH3)2AsO2
·
3H2O)溶於 100 mL 水中，並添加 1 N 的 HCl 使 pH 值為 7.2。4-9-2 固定液 (fixative) 配製
所使用的固定液種類為戊二醛(glutaraldehyde )，成分為: 2.5% glutaraldehyde/
0.1 M buffer +單寧酸(tannic acid)，配製方式為: 0.5 g 的 tannic acid 溶於 20 mL
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hoc Tukey test，SPSS 8.0 統計軟體做分析。P 值小於 0.05 視為組別間的存在有顯 著差異。
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5-3 流式細胞儀分析(Flowcytometry Analysis) – PI 染色
利用流式細胞儀分析– PI 染色可以得到關於 G2期停滯現象變化的資訊，同 樣使用的設定是 5x105的 MG-63 細胞分別加入不同濃度的丁酸 (1-16 mM)培養 不同的加藥時間(2/ 6/ 24/ 48 小時)後，以 PI 染色處理後進行流式細胞儀分析。
在 sub G0/G1 population 的數值方面(M1 值)，各組沒有明顯變化(圖 5-3-1、
圖 5-3-2、圖 5-3-3、圖 5-3-4、圖 5-3-5、圖 5-3-6、圖 5-3-7、圖 5-3-8)。