材料種植
本論文以秈稻 (indica-type)台中在來一號 (Oryza sativa L. cv. Taichung Native 1)的種子做為材料，用 3% sodium hypochlorite 消毒十五分鐘後，以清水洗淨數次，
平鋪於墊有濾紙 (直徑二十公分)的培養皿當中，加入蒸餾水保持濕潤，置於 37℃
黑暗的生長箱中催芽二十四小時，後挑選露白均一之種子移到 27℃黑暗的生長箱 中生長兩天。
處理
以兩天大生長情況一致的水稻黃化幼苗進行處理，取五株黃化幼苗置於鋪有 濾紙 (直徑九公分)含有十毫升處理液 [蒸餾水、sodium nitroprusside (SNP)、
indole-2-butyric acid (IBA)、hemin (Hm)、biliverdin IXα (BV)、apocynin、hydrogen peroxide (H2O2)、100 μM 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl- 3-oxide (cPTIO)、1 mM sodium tungstate (Tu)、1 mM NG-nitro-L-agrinine methyl ester hydrochloride (L-NAME)、0.14 g L-1 hemoglobin (Hb)、1 μM diphenylene iodonium (DPI)、200 μM potassium nitrite (KNO2)或 200 μM potassium ferricyanide (K4Fe(CN)6)]的培養皿中，一個培養皿為一重複，每個處理四重複，放至 27℃黑暗 的生長箱中，分別於各試驗所需的處理時間後，收取黃化幼苗進行分析。
而 HO 抑制劑與鈣離子螯合物、鈣離子通道阻礙劑及 calmodulin 拮抗劑則必 須進行前處理。同樣選取兩天大生長情況一致的水稻黃化幼苗，置於鋪有濾紙 (直 徑九公分)含有十毫升處理液 [蒸餾水、200 μM zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX)、
100 μM ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)、100 μM 1,2-bis(ο-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (BAPTA) 、 100 μM
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1,2-bis(ο-Aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetra(acetoxymethyl) ester (BAPTA/AM)、500 μM lanthanum chloride (LaCl3)、50 μM ruthenium red (RR)、100 μM verapamil、50 μM neomycin sulfate (NEO)、5 mM lithium chloride (LiCl)、100 μM chlorpromazine hydrochloride (CPZ)或 100 μM trifluoperazine dihydrochloride (TFP)]
的培養皿中，放在 27℃黑暗的生長箱中前處理三個小時後，再將黃化幼苗移至分 種子根，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切，厚度為 40 micron，以 螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察根毛之數量，並計算。有些試驗，則於處理 三天後，以電子解剖顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察種子根上根毛之形成狀況，並 且拍照。
一氧化氮螢光影像偵測
一氧化氮螢光之測定主要根據 Xiong 等人 (2009)之方法修改而成。處理後之 水 稻 黃 化 幼 苗 ， 切 下 種 子 根 ， 將 其 完 整 浸 在 20 μM 之 一 氧 化 氮 螢 光 探 針 4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate [DAF-FM DA ， 溶 於 dimethyl sulfoxide (DMSO，0.0025% (v/v))，以 20 mM HEPES buffer (pH 7.5)稀釋之]
中，遮光靜置於室溫下十五分鐘，再浸泡在20 mM HEPES buffer (pH 7.5，新鮮配
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置)中十五分鐘，以去除種子根表面之螢光探針，即可以螢光電子解剖顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察其根尖之一氧化氮螢光 (激發波長與發散波長分別為 495 nm 與 515 nm)。取距離種子根基部約一公分之根的片段，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切或橫切，厚度皆為 40 micron，以螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察種子根切面上之一氧化氮螢光分布情形 (激發波長與發散波長 5-(and-6)-chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydro-fluorescein diacetate [CM-H2DCF DA，
溶於dimethyl sulfoxide (DMSO，0.0025% (v/v))]中，靜置於 37℃生長箱中三十分 鐘，再以蒸餾水清洗種子根數次，以去除表面之螢光探針，即可以螢光電子解剖 顯微鏡 (Nikon SMZ1500)觀察其過氧化氫螢光 (激發波長與發散波長分別為 495 nm 與 515 nm)。取距離種子根基部約一公分之根的片段，以切片機 (D.S.K Microslicer DTK-1000)將其縱切，厚度為 40 micron，以螢光顯微鏡 (Nikon ECLIPSE 50i)觀察種子根切面上之過氧化氫螢光分布情形與側根形成的關係(激發波長與發 散波長分別為495 nm 與 515 nm)。
HO 活性分析
Heme oxygenase (HO)活性分析主要根據 Liu 等人 (2007)之方法修改而成。取 二十五條水稻黃化幼苗的根，加入新鮮配置的3 mL HEPES-Tris [25 mM (pH 7.4)，
內含250 mM mannitol、1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)、1% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP)、10% (v/v) glycerol 及 1 mM dithiothreitol (DTT)]，在冰
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浴中研磨至均質後，以15000 g 於 4℃下離心三十分鐘。取 250 μL 上清液，加入 2 mM desferrioxamine (DFO，以 100 mM HEPES-NaOH (pH 7.2)稀釋之)、10 μM Hm、
0.15 mg mL-1 bovine serum albumin (BSA)、50 μg mL-1 (4.2 μM) spinach ferredoxin (Fd)、0.025 units mL-1 spinach ferredoxin-NADP+ reductase (FNR)、5 mM ascorbic acid (AsA)，最後加入 100 μM NADPH (新鮮配置)開始反應，總反應體積為 1 mL，置於 (1994)之方法修改而成。將水稻黃化幼苗浸於 Evans blue (0.25%，w/v)中十五分鐘，
再移到蒸餾水中浸泡十五分鐘兩次，以進行退染，而後在室溫下靜置於蒸餾水中 隔夜。取十條幼苗的根，切取根尖2 cm 的部分，加入 3 mL 1% (w/v) sodium dodecyl sulphate [SDS，溶於 50% (v/v) methanol 中]研磨至均勻，放至 50℃水浴加熱一個小 時後，在室溫下以13000 g 離心十分鐘，取上清液以分光光度計測量波長 595 nm 的吸光值，即可代表細胞之活力，吸光值愈高則表示細胞活力越低。
統計分析
本論文每一個試驗處理皆為四重複，結果以平均值加上標準差 (standard error, SE)表示。統計分析則以 SAS (statistical analysis system) 9.0 版本進行，採 Duncan’s multiple range test，比較不同處理之間之差異，P<0.05 則視為處理間有顯著差異。
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結果
（一） SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗根之側根與根毛形成之影響
以不同濃度之 SNP、IBA 或 Hm 處理在黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗，三 天後分別觀察其種子根上側根與根毛形成之情形，試驗結果顯示SNP (1-500 μM)、
IBA (0.1-10 μM)與 Hm (5-50 μM)皆可誘導水稻黃化幼苗側根 (圖 1)與根毛 (圖 2、
3、4)之形成。SNP、IBA 與 Hm 分別於處理濃度為 500、1 與 10 μM 時，誘導側根 與根毛形成效果最佳，故後續之試驗即以此為處理濃度。
進一步量化 SNP、IBA 或 Hm 對水稻黃化幼苗側根與根毛形成之影響，分別 以500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm 處理兩天大之水稻黃化幼苗，在處理後一、
二、三天計算側根形成之數量，及在處理一天後計算根毛形成之數量。試驗結果 顯示 SNP、IBA 或 Hm 處理三天後之水稻黃化幼苗，其側根之形成數量有顯著的 提升 (圖 5)，而處理一天即可觀察到根毛數量皆明顯比水處理多 (圖 6)，圖 6a 也 顯示SNP、IBA 或 Hm 處理可增加根毛之長度。
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圖1. 不同濃度 SNP (a)、IBA (b)與 Hm (c)對水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑 暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理不同濃度之 SNP (1、10、100、500 μM)、IBA (0.1、0.5、1、5、10 μM)或 Hm (5、10、25、50 μM)，三天後進行觀 察並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 cm。
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圖2. 不同濃度 SNP 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之SNP (1、10、100、500 μM)，三天後進行觀察，
並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。
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圖3. 不同濃度 IBA 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之IBA (0.5、1、5、10 μM)，三天後進行觀察，
並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。
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圖 4. 不同濃度 Hm 對水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩天之水稻 黃化幼苗為材料，處理不同濃度之Hm (5、10、25、50 μM)，三天後進行觀察，
並取距種子根基部約一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。
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圖5. SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗下生長兩天之水 稻黃化幼苗為材料，分別處理水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm，於處 理後一、二、三天計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表 示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。
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圖6. SNP、IBA 與 Hm 對水稻黃化幼苗根毛數量之影響。以黑暗下生長兩天之水 稻黃化幼苗為材料，分別處理水、500 μM SNP、1 μM IBA 或 10 μM Hm，24 小 時後進行切片後拍照 (a)，計算根毛數量 (b)。每試驗處理四重複，垂直線距表 示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。Bar= 1 μm。
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（二） SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗根側根與根毛之形成需要一氧 化氮的參與，而 Hm 則不需要
為了瞭解 SNP、IBA 與 Hm 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛之形成是否是經由 一氧化氮的作用，水稻黃化幼苗以一氧化氮之清除劑cPTIO (100 μM)與 SNP、IBA 或Hm 共同處理三天。試驗結果顯示 SNP 與 IBA 所誘導之側根 (圖 7、圖 9a)與根 毛 (圖 8)的形成皆因為 cPTIO 處理受到明顯的抑制，說明 SNP 與 IBA 的作用是經 由一氧化氮所引起，而Hm 所誘導之側根 (圖 7、圖 9b)與根毛 (圖 8)的形成則不 受cPTIO 處理所抑制。由於 SNP 分子結構的關係，處理 SNP 後同時會釋放出一氧 化氮、nitrate 與 ferricyanide，為了進一步確認 SNP 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛 之形成是經由一氧化氮的作用而非 nitrate 與 ferricyanide，將水稻黃化幼苗以 100 μM KNO2與100 μM K4Fe(CN)6處理，結果顯示KNO2與K4Fe(CN)6並不能誘導側
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圖 7. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成之影響，與 L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗側根形成之影響。以黑暗下生長兩 天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、 cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或IBA + Tu，cPTIO、SNP、IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、
500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，於處理後三天進行觀察並拍照。每試驗處理四 重複。Bar= 1 cm。
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圖 8. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響，與 L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗根毛形成之影響。以黑暗下生長兩 天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、 cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或IBA + Tu，cPTIO、SNP、IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、
500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，於處理後三天進行觀察，並取距種子根基部約 一公分之根進行拍照。每試驗處理四重複。Bar= 1 mm。
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圖9. cPTIO 對 SNP、IBA (a)或 Hm (b)所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。
以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO、IBA、IBA + cPTIO，cPTIO、SNP、IBA 與 Hm 之濃 度分別為100 μM、500 μM 與 1 μM，於處理後三天計算其種子根上之側根數量。
每試驗處理四重複，垂直線距表示標準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。
a
b
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圖10. L-NAME 與 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗側根數量之影響。以黑暗下 生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，分別處理水、L-NAME、Tu、IBA、IBA + L-NAME 與 IBA + Tu，L-NAME、Tu 與 IBA 之濃度分別為 1 mM、1 mM 與 1 μM，
於處理後三天計算其種子根上之側根數量。每試驗處理四重複，垂直線距表示標 準差，相同字母表示處理間無顯著差異 (P<0.05)。
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圖11. cPTIO 對 SNP、IBA 或 Hm 所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響，
及L-NAME 及 Tu 對 IBA 所誘導之水稻黃化幼苗中一氧化氮生成之影響。以黑暗 下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，(a) 處理水、100 μM KNO2、100 μM K4Fe(CN)6、cPTIO、SNP、SNP + cPTIO、Hm、Hm + cPTIO 6 小時，(b) 處理水、
cPTIO、IBA、IBA + cPTIO、IBA + L-NAME 或 IBA + Tu 24 小時，cPTIO、SNP、
IBA、Hm、L-NAME 與 Tu 之濃度分別為 100 μM、500 μM、1 μM、1 mM 與 1 mM，
於處理後取根尖一公分以20 μM DAF-FM DA 染色後觀察並拍照。每試驗處理四 重複。Bar= 1 mm。
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圖12. SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與側根 形成部位之關係。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、500 μM SNP 與1 μM IBA 42 小時後，取距種子根基部一公分之根以 20 μM DAF-FM DA 染色 後進行縱切並拍照。白色箭頭所指為側根根原基。每試驗處理四重複。Bar= 0.2 mm。
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圖13. SNP 與 IBA 所誘導之一氧化氮生成於水稻黃化幼苗種子根中之分布與根毛 形成部位之關係。以黑暗下生長兩天之水稻黃化幼苗為材料，處理水、500 μM SNP 與1 μM IBA 24 小時後，取距種子根基部一公分之根以 20 μM DAF-FM DA 染色 後進行橫切並拍照。每試驗處理四重複。Bar= 0.5 mm。
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（三） SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗根側根與根毛之形成與 Ca2+之 關係
為了瞭解Ca2+是否參與在SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛形成之途
為了瞭解Ca2+是否參與在SNP 與 IBA 誘導水稻黃化幼苗側根及根毛形成之途