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1. 實驗動物
斑馬魚使用成年野生種 (pronounced star-AB)斑馬魚(Danio rerio)，母系來自 台灣班馬魚中心—中央研究院分支 (Taiwan Zebrafish Core Facility at Academia Sinica)，以除氯曝氣水飼養在實驗室裡 50×25×25cm 的魚缸中，光暗周期為 14/10 小時，魚飼料每日餵食一次並測量水溫使其維持在 26-28℃。實驗進行時斑馬魚 週齡皆為 16 週，取體型相近之成年公魚分組在光週期中進行實驗。
2. 芬普尼之實驗準備
純芬普尼粉末由 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)購得。以 0.5g 的芬普尼 粉末，與助溶劑 50mL 的 DMSO (Dimethyl sulfoxide;0.5%)並加入二次水混合直到 體積 5L 以配製成 1 ppm 的芬普尼原液 (含 0.1%之 DMSO)，再分別以二次水稀釋
-24 Noldus, Wageningin, The Netherlands) 做為主要觀察記錄工具。行為實驗中半 致死量實驗將斑馬魚飼養在固定體積的魚缸 (20 cm×10 cm×20 cm)，於不同濃
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4. 斑馬魚胚胎側線毛細胞的螢光染色
以 MitoTracker Green FM1-43染劑在活體中標定側線毛細胞上之神經丘中 MET channels 並測量其數目。將仔魚(4dpf)以 FM1-43 (Invitrogen) 3μM 處理 15 秒，接著再以麻醉劑(MS 222, Sigma)麻醉後進行以 400x 螢光顯微鏡拍攝 (Olympus BX60 Microscope, Canon DS126271)。
5. 免疫組織化學染色
行為實驗完後取下斑馬魚腦組織，再以 10%中性福馬林 (formalin) 浸泡固 定，目的在於防止腐敗並保持生前原來構造。固定完成後以石蠟(paraffin)包埋，
並利用旋轉式精密切片機 (Leica RM2135, Wetzlar, Germany)切製成 5 µm 之組織 切片，接著將組織切片貼片保存。在攝氏 60 度加熱進行脫蠟：經數次甲醇、95%
酒精、二次水以洗淨石蠟後，浸於 epitope retrieval buffer 中水浴加熱二十分鐘進 行抗原修復，並加入 peroxidase block 及 protein block (abcam, Cambridge, United Kingdom)；其次分別加入適當濃度之一級抗體反應一小時，再加入含有
horseradish peroxidase (HRP)之適當濃度 Novelinktm polymer detection system 1 二 級抗體標定。實驗使用抗體如表 1。經 substrate buffer 稀釋之 3,3′
-Diaminobenzidine chromogen (DAB; abcam, Cambridge, United Kingdom)相對應 作為呈色系統，呈色後共染 hematoxylin solution (Leica, polymer detection
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system)。上述每一步驟間皆經磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (phosphate-buffered saline;
PBS) 清洗。最後浸泡二次水、95%酒精、甲醇數次以進行脫水、封片。使用光 分鐘以取組織上清液。其次，利用二喹啉甲酸測定法 (Bicinchoninic acid assay, BCA assay; PierceTM; ThermoFisher Scientific，USA) 藉由微量光電比色計
( Microplate Spectrophotometer, uQuant, Biotek Intruments, Inc., Vermont, USA) 於 562 nm 波長定量上清液中蛋白質。加入等體積的 2x sample buffer 至組織樣品 中，煮沸 3 分鐘後定量分裝保存於冰庫。三重複的定量樣本透過自製之十二烷基 硫酸鈉聚合膠體 (Discontinuons sodium dodecylsuifate-polyacrylamide gel,
SDS-PAGE)進行電泳：將 25 g 之蛋白質隨不同分子量大小電泳分離，隨即轉印 於聚二氯亞乙烯膜 (polyvinylidene difluoride membrane, PVDF; GE Healthcare Life Science, Barrington,Illinois, USA) 上。以脫脂奶粉進行印漬封閉 (Blocking) 一小時。後續以含界面活性劑之酸鹽緩衝生理食鹽水 (phosphate-buffered saline with 0.1% Tween-20; PBST) 清洗後接合一級抗體，一抗反應時間為 12-16 小時；
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回收一抗後與二級抗體反應一小時，再以冷光呈色劑 (Enhanced
chemiluminescence, ECL; GE Healthcare Life Science, Barrington,Illinois, USA) 試 劑組偵測特定抗原-抗體複合物。並且上開每步驟間皆經 PBST 洗滌數次。最後利 用攝像系統 LAS-4000 (Fujifilm; Tokyo, Japan) 予以數位化，數位影像以 Image-J 軟體 (Version 1.48t, Wayne Rasnabd, Washing DC, USA) 進行定量分析：以像素 密度方式分析各組蛋白質條帶光密度並比較。實驗使用抗體如表 1。
7. 統計分析
各組檢測出來的數值均由平均值±平均值標準誤差（standard error of the mean, SEM）來表示，且用單因子變異數分析 (one-way analysis of variance, one-way ANOVA)以及 S-N-K (Student-Newman-Keuls multiple range test )多重差距檢定來 分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**P<0.01 以及*P<0.05 表示。
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