2.1 虹彩病毒誘發之點帶石斑之微陣列晶片分析
以 GeneSpring GX 11.5（Agilent Technologies）軟體進行分析虹彩病毒誘發 之點帶石斑頭腎基因微陣列晶片，首先以baseline transformation 將背景值平均化 後，就可進行扣除系統性誤差（systematic variation）之步驟。而為了避免因大多 數無顯著差異表現的基因使扣除系統性誤差正常化後可能會產生較大誤差，因此 再使用LOWESS（Locally Weighted Scatterplot Smoother） normalization 將其正 常化。以虹彩病毒誘發處理組中任一天基因表現量有大於兩倍或小於兩倍為基準。
篩選出符合條件的候選基因，並挑選出候選基因之質體以進一步進行轉型作用
（transformation）。
2.2 勝任細胞之製備與轉型作用
材料：
Escherichia coli DH-5α strain
LB broth（Sigma）
Agar（Simga）
Ampicillin（MDBio, Inc）
pBlueScript SK(-) vector （Stratagen）
挑選一個大腸桿菌之 DH-5α 菌株之單一菌落置於 3 ml 之 LB 培養液中，在
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37℃環境下以 200 rpm 之轉速旋轉培養隔夜。將 3 ml 之菌液倒入滅菌過之 100 ml LB 培養液中，以 200 rpm 轉速培養，直至 OD600值約0.4 至 0.6 之間。之後將菌 液冰浴10 分鐘，再分裝至 50 ml 離心管（Falcon）中，以轉速 4,000 rpm 離心 15 分鐘，吸去上清液，以5 ml 之 0.1 M CaCl2溶液將細菌打散懸浮並冰浴5 分鐘。
將打散均勻之菌液在4℃環境下以 4,000 rpm 之轉速離心 15 分鐘，離心後吸去上 清液，以5 ml 之 0.1 M CaCl2溶液將細菌打散懸浮並冰浴5 分鐘。將打散均勻之 菌液在4℃環境下以 4,000 rpm 之轉速離心 15 分鐘，將細菌懸浮於 2 ml 含 0.1 M CaCl2、15% glycerol 溶液中，置於冰上隔夜。每 50 μl 分裝於微量離心管中，保 存於-80℃環境中，此即勝任細胞（competent cells），可做為質體 DNA 轉型作用 使用。
將製備好之 50 μl DH-5α 勝任細胞置於冰上解凍後，加入 10 ng 之質體 DNA 混合均勻後置於冰上冰浴30 分鐘。再放入 42℃水浴 90 秒進行熱休克（heat shock）
後快速插入冰中冰浴2 分鐘，加入 1 ml 之 LB 培養液於 37℃、200 rpm 轉速下旋 轉培養 30 分鐘。取 100 μl 菌液塗佈平板於經 37℃預熱過之含 100 μg/ml 之 ampicillin 的 LB 培養基上，在 37℃下培養至隔夜。
2.3 質體 DNA 之純化及定序校準比對
材料：
LB broth（Sigma）
Ampicillin（MDBio, Inc）
High-Speed Plasmid Mini Kit（Geneaid）
挑取經轉型作用培養於含 100 μg/ml ampicillin 的 LB 培養基上之單一菌落，
置於3 ml 之含 100 μg/ml ampicillin LB 培養液中，在 37℃下培養隔夜。將菌液倒
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入1.5 ml 微量離心管中以 5,000 x g 離心 5 分鐘，倒去上清液，再將剩餘之菌液 倒入1.5 ml 微量離心管中以 5,000 x g 離心 5 分鐘，倒去上清液，使用 Geneaid 之High-Speed Plasmid Mini Kit 進行質體 DNA 之純化。首先加入 200 μl 之 PD1 Buffer 使細菌完全懸浮均勻後，加入 200 μl PD2 Buffer 並輕微顛倒混合均勻，再 加入300 μl PD3 Buffer 並立即上下顛倒混均後，以 14,000 x g 轉速離心 3 分鐘。
離心後取其澄清上清液加入含PD Colunm 之 2 ml 收集管中以 14,000 x g 轉速離 心1 分鐘後，倒去流過管柱之液體。加入 400 μl W1 Buffer，以轉速 14,000 x g 離心1 分鐘，倒去通過管柱液體。再加入 600 μl Wash Buffer 後，使用 14,000 x g 轉速離心1 分鐘，倒去流通管柱液體後再以轉速 12,000 x g 離心 5 分鐘。將 PD Column 移至另一管全新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 50 μl 滅菌過之二次蒸餾水 並等待兩分鐘後，以12,000 x g 轉速離心 5 分鐘，所得液體即為質體 DNA。
質體 DNA 之定序步驟是使用 ABI 3730 DNA analyzer 定序儀並以 ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit 及 FS AmpliTaq DNA polymerase（Perlin-Elmer）以質體 DNA 的 T3 及 T7 啟動子引子開始進行 DNA 核酸定序。在得到不包含載體之基因序列後使用DNAStar software 去除掉 5’端之 EcoR I 限制酶切位及 adpator 序列以及 3’端之不明的序列片段後，去除完後的全
部基因序列再使用DNAstar Lasergene 7.1 軟體進行相似性比對校準（alignment）
後相同的序列片段會排列形成連續體（contig），比對出來之連續體再由NCBI 之 BLASTX 程式中的已知基因序列資料庫進行比對。如有比對出已知之基因序列 再使用UniProt Knowledgebase 確認其蛋白質之功能，再依其功能性進行分類。
2.4 實驗用點帶石斑之飼養
材料：
Epinephelus coioides
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將平均長度 8.8±0.4 cm、體重 12.4±1.8 g 之點帶石斑以每 15 隻為一單位，每 一單位飼養在含10 L 之鹽度為千分之 30 的海水缸中，在飼養及實驗期間每日換 海水二分之一、餵食兩次，光週期暗週期各12 小時，飼養期間海水溫度為 25℃。
2.5 細胞繼代培養
材料：
GK-2 細胞株
75T 培養瓶（BD Flcon）
Fetal Bovine Serum（GIBCO）
Penicillin G sodium, 100 units/ml（GIBCO）
Streotimycin, 100 μg/ml（GIBCO）
L-glutamine（GIBCO）
Leibovitz’s L-15 medium（GIBCO）
Phosphate Buffered Saline（GIBCO）
0.25% trypsin solution（GIBCO）
本實驗室所使用之石斑魚腎臟細胞株（GK-2 cell line）由點帶石斑魚
（Epinephelus coioides）腎臟細胞初代分離而來(Yeh et al., 2008)以 GK-2 細胞株 培養於75T 培養瓶內，使用 10% FBS（Fetal Bovine Serum）、penicillin-streptomycin
（Penicillin G sodium, 100 units/ml; Streptomycin sulfate, 100 μg/ml in 0.85% Saline）
及2 mM L-glutamine 的 Leibovitz’s L-15 medium（含 10%胎牛血清之 L-15 培養液）
培養於 28℃培養箱中。待細胞長滿後，吸去培養瓶中原本之培養液後以滅菌過
之PBS（Phosphate Buffered Saline）清洗兩次並吸去後，加入 1 ml 含 0.25%胰蛋 白酶（Trypsin）之 PBS 溶液作用。待作用至細胞懸浮後，加入適量之含血清培
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養液中止胰蛋白酶之活性並將細胞打散至均勻，之後吸去2/3 體積細胞液後再加 入適量培養液。
2.6 虹彩病毒之增殖
材料：
GIV（本實驗室）
GK-2 細胞株（本實驗室）
175T 培養瓶（BD Falcon）
10% Fetal Bovine Serum（GIBCO）
2% Fetal Bovine Serum（GIBCO）
Penicillin G sodium, 100 units/ml（GIBCO）
Streotimycin, 100 μg/ml（GIBCO）
L-glutamine（GIBCO）
Leibovitz’s L-15 medium（GIBCO）
Phosphate Buffered Saline（GIBCO）
0.25% trypsin solution（GIBCO）
將 GK-2 細胞培養於 175T 之培養瓶中，再將細胞繼代並增加至共 10 盒 175T
培養瓶後，待細胞生長至八分滿後即可進行細胞接種。將 GIV 病毒以 MOI
（multiplicity of infection）為 0.01 接種到 GK-2 細胞株之後，將原本之培養液吸 去後補入含2% FBS-L-15 培養液，在 28℃環境下培養 7 天，待 CPE（cytopathic effect）現象完全出現後收集其培養液。
2.7 病毒效價之測定
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材料：
GIV（本實驗室）
GK-2 細胞株（本實驗室）
Fetal Bovine Serum（GIBCO）
Penicillin G sodium, 100 units/ml（GIBCO）
Streotimycin, 100 μg/ml（GIBCO）
L-glutamine（GIBCO）
Leibovitz’s L-15 medium（GIBCO）
Phosphate Buffered Saline（GIBCO）
0.25% trypsin solution（GIBCO）
24 well plate（Nunc）
將 GK-2 細胞以每孔含 1 x 105個細胞培養於24 孔細胞培養盤中，在 28℃下
培養隔夜後，待細胞貼附於盤底上並且生長至密度為50%滿之單層細胞後即可進
行病毒效價之測定。實驗用之GIV 病毒株取自 1999 年於小琉球地區罹病石斑魚 脾臟器官中分離出之病毒株（Lai et al., 2000）。首先將待測病毒以 2% FBS-L-15 培養液進行十倍之序列稀釋將病毒稀釋至濃度為 10-1至 10-8，然後將原本於 24 孔細胞培養盤中之培養液吸去後，加入 PBS 清洗並吸去後，每一稀釋倍率 4 重 覆依序加入不同之稀釋倍數的病毒液1 ml，而對照組則加入 1 ml 之不含病毒的 2% FBS-L-15 培養液，培養於 28℃環境中，且每日以倒立式顯微鏡觀察其細胞 之病變的情形，連續觀察7 日後並紀錄，而後再以 Reed and Muench（1938）之 方法進行病毒效價之測定。
2.8 石斑魚之免疫刺激物注射及頭腎、脾藏組織收集
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材料：
Lipopolysaccharide（Simga）
Polyinosinic:polycytidylic acid（Sigma）
GIV（本實驗室）
將平均長度8.8±0.4 cm、體重 12.4±1.8 g 之點帶石斑禁食一天後，以每處理 組各15 隻為一組，分別注射 200 μg LPS、200 μg poly I:C、100 μl 107 TCID50 /ml GIV 之病毒液，並取無注射過任何藥劑之 5 隻魚做為控制組。分別在注射後 1、
3、5 天，每處理組中隨機取 5 隻魚之頭腎及脾臟組織，而控制組也將魚隻犧牲 後取出其頭腎及脾臟組織。
2.9 石斑魚頭腎組織與脾臟組織之 RNA 萃取及純化
材料：
Trizol（invitrogen）
Chroloform（Merck）
Ethanol（Merck）
DEPC（Sigma）
DNaseI（Roche）
RNA clean & Concentrator（ZYMO RESEARCH）
頭腎組織及脾臟組織取出後，將之放入250 μl 之 Trizol 溶劑中用研磨棒搗碎，
待組織完全磨碎後，加入50 μl chroloform 混合均勻後置於冰上五分鐘。以 13,000 x g、4℃低溫離心 15 分鐘，離心後取其澄清上清液加入 200 μl 絕對酒精中，以 13,000 x g、4℃低溫離心 15 分鐘並移走上清液，待酒精蒸散完全後加入 DEPC
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處理過的水回溶沉澱物。回溶後之溶液使用DNase I（Roche）處理去除 DNA 並 以ZYMO RESEARCH 之 RNA clean & Concentrator 進行 RNA column-purification 純化。
2.10 cDNA 之合成
材料：
Hexamer（Sigma）
dNTP（Sigma）
DTT（Sigma）
Reverse transcriptase（Stratagene）
DEPC（Sigma）
將純化好的RNA 以同一處理組每一樣本各取 1 μg 之 total RNA 混合，混合 均勻後之混合物取1 μg total RNA 出來，置於 70℃五分鐘以解開其二級結構，之 後迅速插入冰中冰浴。之後再加入1 μl 之 10 mM hexamer、1 μl 之 10 mM dNTP、
1 μl 之 0.1 M DTT、1 μl 之 50 U 反轉錄酶（Stratagene）以及 2 μl 10 X buffer，使 用DEPC 處理過的水補至最終體積為 20 μl，以 37℃反應一小時、92℃五分鐘中 止反應之條件，合成出的cDNA，並保存於-80℃環境中以待後續實驗使用。
2.11 即時定量聚合酶鏈鎖反應之專用引子設計
即時定量聚合酶鏈鎖反應中所使用之引子對係根據所需偵測之目標基因序 列，使用Primer Express 3.0（Aplied Biosystems）軟體設計，並挑選用於 SYBR Green I 之引子，所選擇之引子需避免引子間無二聚體（primer dimer）與交錯的
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二聚體（cross dimer），引子自身無莖環結構（hairpin），單一引子無法形成二聚 體（self-dimer），鍵結數及 GC 間的鍵結相對較少，且 Tm 值介於 58-60℃。
2.12 即時定量聚合酶鏈鎖反應
材料：
Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（Fermentas）
即時定量聚合酶鏈鎖反應之步驟是使用 LightCycler 480 Real-Time PCR System（Roche）儀器運作，利用的螢光染劑為非專一性的 SYBR Green I。取 20 ng cDNA 加入內含 200 nM 之先前所設計好的目標基因專一性引子對、2.5 μl Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2x）（Fermentas）之混合液中，最 後加入DEPC 處理過之水將最終體積補足至 5 μl。qPCR 之反應溫度循環條件為：
起始溫度95℃ 5 分鐘，接著為 60 個循環之 95℃ 10 秒；60℃ 10 秒；72℃ 10 秒，最後以65℃（1.5℃/s）1 分鐘；最後溫度下降至 40℃，最後以解離曲線（melting curve）測試其 Tm 值，以確定引子對之間是否會自行鍵結互補形成雙股 DNA，
或是樣本在實驗過程中是否被污染，此步驟每樣本各基因進行三重覆，以 18s
rRNA 為基準求得各基因之相對表現量。
2.13 即時定量聚合酶鏈鎖反應結果之分析
由即時定量聚合酶鏈鎖反應運算出之不同樣本的特定基因 CT值與同一樣本 中穩定表現之18s rRNA 基因 CT值相減後所算出之閾值△CT，而注射免疫刺激物 處理組之特定基因△CT再與對照組相之相同特定基因△CT扣除後可再得△△CT值，
再將其值代入2-△△Ct運算，詳細計算公式如下：
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△CT = CT （target gene） - CT （reference gene）
△△CT = △CT （treatment target gene） - △CT （control target gene）
Relative expression of target gene = 2-△△Ct
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