3.1 虹彩病毒誘發之點帶石斑之微陣列晶片分析
使用 GeneSpring GX 11.5（Agilent Technologies）軟體分析虹彩病毒處理組 與無注射之對照組晶片子經雜合反應之結果後，以正調控或負調控大於對照組兩 倍以上或以下為條件進行篩選後總共可得到315 個選殖株。其中正調控兩倍以上 方面有 124 個選殖株，負調控兩倍以下基因則篩選出 202 個選殖株，其中有 11 個clone 是在正調控兩倍以上及負調控兩倍以下的篩選條件下皆有出現，將此 315 個選殖株進行轉型的步驟後，挑選單一菌落小量放大後抽取其質體後定序。
3.2 質體 DNA 定序及校準比對
純化之步驟後所得到之選殖株，以 T3 與 T7 啟動子引子進行定序的過程。
將定序出來的315 個全部序列經過校準（alignment）後，出現了總共 161 個的連 續體，再將此161 個連續體序列整段使用 BLASTX 程式比對 NCBI 網站中的蛋 白質資料庫後，總共比對出現 81 個基因，其相似度介於 36%到 100%之間，其 中正調控兩倍以上共比對出39 個基因，而負調控兩倍以下者則比對出 48 個基因，
5 個基因是在正調控兩倍以上及負調控兩倍以下皆有比對出。而另外的 80 個連 續體在NCBI 的蛋白質資料庫中則比對不出相似的基因，其中有 33 個正調控兩 倍以上篩選出的連續體以及54 個負調控兩倍以下的連續體， 7 個連續體在兩組 中都有出現。將比對出來之基因從Uniprot 資料庫中比對其蛋白質依其所標示之
功能分門別類將相似功能基因歸類在一起，在正調控兩倍以上所比對出的39 個
基因中（表一），其中主要為訊息傳遞（signal transduction）功能，佔 21%，包 含bloodthirsty、CD9 antigen、Ly-6/neurotoxin-like protein 1、insulin-like growth
23
factor binding protein、neoverrucotoxin subunit homolog、Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2、urokinase plasminogen activator surface receptor 以及 very large inducible GTPase-1 等八個基因；第二大族群為佔 18%的新陳代謝（metabolism）
功能，含有betaine-homocysteine S-methyltansferase、carboxypeptidase N catalytic chain、ferritin heavy subunit、fructose-bisphosphate aldolase B、hemoglobin alpha chain、hemoglobin beta chain 以及 Mid1-interacting protein 1 等七個基因；其次分 別 為 免 疫 反 應 （immune response）占 16%，共有 asparaginyl endopeptidase (legumain)、beta-2 microglobulin、immunoglobulin mu heavy chain、interferon stimulated gene 15、vig-1 以及 RNA helicase DHX58 homolog 等六個基因；結構
（structure）相關基因有 cofilin-2、collagen type I alpha 1、profilin 1 以及 sorting nexin 3 等四個基因，佔 11%；與能量（energy）相關之基因占 10%，包含 ATP synthase F0 subunit 6、cytochrome b、cytochrome c oxidase subunit III 以及 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, assembly factor 1 等四個基因；而 參與蛋白質合成（protein synthesis）路徑的基因則含 8%，共計有 60S ribosomal protein L34、60S ribosomal protein LP1、pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor 等三個基因；調控蛋白質降解（protein degradation）過程的基 因占8%，包含 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 homolog、HECT E3 ubiquitin ligase 以及 ubiquitin-conjugating enzyme E2 D2 等三個基因；與轉錄及轉 譯調控（transcription/translation regulation）有關之基因占 8%，分別為 poly A binding protein、cytoplasmic 1 b、bromodomain-containing protein 1 以及 reverse transcriptase-like protein 等三個基因（圖一）。
而在負調控兩倍以下條件之連續體群中所比對出的基因中經過依其轉譯出
之蛋白質功能分類後（表二）。其中 43%為新陳代謝相關之基因，分別是
acyl-coenzyme A thioesterase 13、alanine aminotransferase、alcohol dehydrogenase Class VI、aldehyde dehydrogenase, mitochondrial precursor、betaine-homocysteine
24
S-methyltansferase、cathepsin A、CNDP dipeptidase 2、Glutathione S-transferase theta-1、NAD-dependent deacetylase sirtuin-5、omega-amidase NIT2、hemoglobin alpha chain、Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase、dihydrolipoamide S-succinyltransferase、peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase 以及 protein disulfide isomerase A6、pyruvate kinase、
serine:pyruvate/alanine:glyoxylate aminotransferase 、 sorcin 以 及 UDP-glucose 6-dehydrogenase 等 20 個基因；其次為能量合成相關，占 21%，共 10 個基因，
分別為ATP synthase F0 subunit 6、cytochrome b、cytochrome c oxidase subunit 8B、
cytochrome c oxidase subunit I、cytochrome c oxidase subunit II、cytochrome c oxidase subunit III、NADH dehydrogenase subunit 1、NADH dehydrogenase subunit 4、NADH dehydrogenase subunit 5 以及 NADH dehydrogenase subunit 6；與構形 相關的基因占16%，分別為 coronin-1A、FAM18B、keratin 8、keratin type II E3、
NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 1、PDZ domain-containing protein 1 以及 tropomyosin alpha-4 chain、troponin C 等八個基因；與蛋白質合成 路徑相關基因有六個，分別是40S ribosomal protein S2、40S ribosomal protein S4、
40S ribosomal protein S15、40S ribosomal protein S27、60S ribosomal protein L4 以 及60S ribosomal protein L17，占了 12%；而轉錄與轉譯調控相關基因僅占 4%，
只有thioredoxin interacting protein 與 eukaryotic translation elongation factor 2 兩個 基因；免疫反應相關之基因也僅占了4%，僅 heat shock protein 90 和 peptidylprolyl isomerase A 等兩個基因（圖二）。
25
3.3 即時定量聚合酶鏈鎖反應之專用引子設計
由正、負調控兩倍以上或以下比對出來的基因中挑選可能在病毒與魚體間的 交互功防作用較有關係者，且加入現有已知之魚類體內參與免疫反應調控有關且 在 點 帶 石 斑 魚 體 內 也 有 之 基 因 如 NF-kappa B (Kong et al., 2011) 、 interferon-induced GTP-binding protein MxI (Lin et al., 2006)、interleukin 8(Sun et al., 2011)、 interleukin 1β (Lu et al., 2008)、tumor-necrosis factor α (Pavlikova and Arukwe, 2011)、cyclooxygenase-2 (Castillo-Briceño et al., 2011)，並依據點帶石斑 之基因序列以Primer Express 3.0（Aplied Biosystems）軟體設計出之 30 組即時定 量聚合酶鏈鎖反應專用之引子對（表三）。
3.4 即時定量聚合酶鏈鎖反應後之目標基因表現量結果
用即時定量聚合酶鏈鎖反應分析微陣列晶片所篩選出的正調控組之 17 基因 中依各基因在施打虹彩病毒處理組中不同時間點表現量之趨勢可大制分為三類，
第 一 類 為 在 注 射 後 第 一 天 達 到 最 高 點 再 逐 漸 下 降 之 趨 勢 ， 總 共 有 beta-2-microglobulin、CD9 antigen、asparaginyl endopeptidase、ferritin heavy subunit、
reverse transcriptase-like protein 以及 insulin-like growth factor binding protein 這六 個基因；第二類為在注射後第五天其表現量達到高峰，分別為vig-1、RNA helicase DHX58 homolog、interferon-stimulated gene 15、HECT E3 ubiquitin ligase、26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 homolog、Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2、urokinase plasminogen activator surface receptor 以及 very large inducible GTPase-1 這八種基因；而第三類則是在施打後一、三、五天中表現量 無明顯上升或下降，皆為穩定表現出一定量之基因，如 ubiquitin-conjugating enzyme E2 D2、immunoglobulin mu heavy chain 以及 Ly-6/neurotoxin-like protein 1 這三個基因（圖四）。
26
用即時定量聚合酶鏈鎖反應分析微陣列晶片所篩選出的4 個負調控基因中，
依注射虹彩病後一、三、五天之基因表現量趨勢可細分為二類，第一類為其表現 量在第一天即達到最高量之基因，僅cytochrome c oxidase subunit I 一種；第二類 為表現量逐漸增加，在施打後第五天達到最高者，包含peptidylprolyl isomerase A、
UDP-glucose 6-dehydrogenase 以及 heat shock protein 90 等三種基因（表四與圖 五）。
而在正調控與負調控篩選中皆有出現並用於即時定量聚合酶鏈鎖反應的三 個基因中，依據各基因於不同時間點表現量之趨勢分析後可分為，第一類，表現 量 逐 漸 上 升 ， 並 於 注 射 虹 彩 病 毒 後 第 五 天 其 表 現 量 達 到 最 大 量 ， 即 為 Betaine-homocysteine S-methyltransferase 基因；第二類為其表現量於施打後第三 天出現最大量，即是hemoglobin alpha chain 基因；第三類為在注射虹彩病毒後 一、三、五天間的表現量均很接近，為cytochrome B 基因（表四與圖六）。
六個挑選的石斑魚免疫相關基因依其施打虹彩病毒後不同時間點表現量之 表現量趨勢可分為兩類，一類為施打後第一天即大量表現，其後逐日降低，共有 Interleukin-1β、Interleukin-8、tumor-necrosis factor α 以及 cyclooxygenase-2 等四 種基因；而另一類則是其表現量在第五天出現大量，分別是 Interferon-induced GTP-binding protein MxI 以及 NF-κB c-Rel subunit 等兩個基因（圖七）。
27 等基因可高達控制組表現量的10 至 20 倍以上，且在 PLAUR、HERC、ISG15、
IL-1b、IL-8、MxI 等基因其表現量最大時更高於控制組 100 倍之多，顯示基因可 能在點帶石斑頭腎組織中對於病毒之入侵有較高之感受性，且可能是魚體抵禦病 感染後，血清中的B2M 會增加，因此可做為一生物指標（biomarker）(Chitra et al., 2011; Zijlstra et al., 1990)。
CD9 antigen 是一種分佈在細胞表面之四穿膜蛋白（tetraspanin），其特點為 具有四個疏水性區域穿插入細胞膜中，四穿膜蛋白主要參與了細胞之移動、生長、
貼附、訊息傳遞、細胞型態、細胞間的融合、癌症生成（carcinogenesis）以及與 外來病原體的感染有關。而近年研究指出HTLV-1（human T-lymphotrophic virus-1
）與HIV-1 會在細胞膜上之 TEM（tetraspanin-enriched microdomains）中行出芽
（budding）動作將細胞內組裝好的病毒顆粒送出，而將受 HIV-1 感染之 HeLa