細胞培養及穩定性轉染 (Stable transfection)
HepG2 cells 和 Chang livr cells 以含有 10%胎牛血清 (HyClone, Logan, Utah)
的Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 37℃培養。HepG2 cells 以 SuperFect® transfection reagent (Qiagen, Valencia, CA) co-transfected 2.5 μg AlwNI-linearized pNF-κB-Luc 或 pAP-1-Luc DNA (Stratagene, La Jolla, CA) 和 2.5 μg EcoRI-linearized pSV3-neo DNA。48 小時後，繼代細胞 並且利用 400 μg/ml G-418 (Promega, Madison, WI)篩選 (賴,2001)。重組細胞株命
名為 HepG2/NF-κB 或 HepG2/AP-1，以含有 10%胎牛血清 (HyClone, Logan, Utah) 及 400 μg/ml G-418 的 Dulbecco modified Eagle medium (DMEM)培養。
乙醛的處理
乙醛 (Sigma, St. Louis, MO)利用 phosphate-buffered saline (137 mM NaCl, 1.4 mM KH2PO4, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, pH 7.2)新鮮配置。HepG2 cells 培 養於 25-cm2 flasks 中 24 小時後，加入以 DMEM 稀釋不同濃度的乙醛。在 25-cm2 flasks 的瓶口上封 parafilm 避免乙醛的揮發。
Gelatin zymography
在本實驗中以gelatin zymography 測定細胞培養液中 MMP 的活性。HepG2 cells 以不同濃度的乙醛處理 24 小時後，收集細胞培養液加入等量的兩倍 non-reducing sample buffer (0.5 M Tris-HCl, 20% glycerol, 10% sodium dodecyl
sulfate (SDS), 0.2% bromophenol blue, pH 6.8)，在 4℃下利用含有 1 mg/ml gelatin 的 7.5% polyacrylamide gels 以 90 伏特電泳 120 分鐘分離蛋白質。Gels 之後再利用 2.5% Triton X-100 清洗 10 分鐘以去除 SDS 之後於 incubation buffer ( 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2·2H2O, 50 mM NaCl, 0.05% Brij35, pH 7.6)中 37℃作用 48 小時，使 MMP 將 gels 中的 gelatin 水解。最後以 Coomassie brilliant blue R-250 染 30 分鐘，再以 40% methanol 和 10% acetic acid 退染。若具水解 gelatin 的活性會呈現透明與背景的藍色成對比 (圖 2)。Gels 上的 band 的密度是 利用Gel-Pro® Analyzer (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD)分析。
Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
利用 acid guanidium-phenol-chloroform 法萃取 HepG2 cells 的 RNA 後 (Chomczynski and Sacchi, 1987) ， 1 μg 的 RNA 以 oligo(dT)15 的 引 子 與 SuperScriptTMIII (Invitrogen , Carlsbad, CA)進行反轉錄。之後 2 μl 的 cDNA 產物 利 用 Taq polymerase (Promega, Madison, WI)進行 PCR 以放大 MMP-9 和 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNA 的量。PCR 中使用的 MMP-9 的引子序列正股為：5’-CGATGACGAGTTGTGGTCCCTGGGC-3’，負股 為：5’-AATGATCTAAGCCCAGCGCGTGGC-3’；而 GAPDH 的引子序列正股為：
5’-CACCCATGGCAAATTCCATGGCACC-3’，負股為：5’-CCTCCGACGCCTGC TTCACCACC-3’。
架構MMP-9 啟動子冷光報導質體 (Construction of MMP-9 promoter/reporter plasmids)
MMP-9 wild-type 及 mutants 啟動子是由 Douglas D. Boyd (MD Anderson Cancer Center, University of Texas, Houston)提供。而最先架構 MMP-9 啟動子的是 Hiroshi Sato (Cancer Research Medicine, Kanazawa University, Kanazawa, Japan) (Sato and Seiki, 1993)。 MMP-9 冷光報導質體是將 MMP-9 啟動子上的 -670 到 +54 片段以 PCR 放大後，將其架接至 pGL3-basic vector 。Wild-type 和 mutant 的 NF-κB 和 AP-1 結合位序列分別為: NF-κB (wild-type) GGAATTCCCC, NF-κB (mutant) TTAATTCCCC; AP-1 (wild-type) TGAGTCA, AP-1 (mutant) TATGTCA (圖 3)。 最後以 DNA 定序確認並利用 Qiagen plasmid midi kit (Qiagen, Valencia, CA)製備質體。
NF-κB 及 AP-1 活性測試 (Luciferase assay)
HepG2/NF-κB、AP-1 經不同濃度的乙醛處理 8 小時之後，以 350 μl Triton lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, 1 mM dithiothreitol, pH 7.8)使細胞 溶解，在 4 ℃下 12,000 xg 離心 2 分鐘。之後加入 20 μl 的細胞溶解液與 20 μl 冷光試劑(470 μM luciferin, 33.3 mM dithiothreitol, 270 μM coenzyme A, 530 μM ATP, 20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)4Mg(OH)2, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, pH 7.8) 以 luminometer (FB15, Zylux Corp., Maryville, TN)測定冷光值，單位以 relative luciferase unit (RLU)表示。活化倍率的計算方式是以乙醛處理細胞的 RLU
除以未受乙醛處理細胞的RLU。
Biotinylated electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
HepG2 cells 處理不同時間的乙醛後，收集細胞核的萃取液(Hsiang et al, 2002)。
定量 10 μg 的 DNA 後加入會與 NF-κB 結合的 biotin 標定的雙股核苷酸進行反 應。以6％ polyacryamide gel 電泳後，利用硝酸纖維膜轉印再以 blocking solution 阻 斷 非 特 異 性 的 結 合 位 後 加 入 alkaline phosphatase-conjugated streptavidin (Chemicon, Australia) ， 以 chemiluminescence (ECL system, Amersham, Buckinghamshire, UK)呈色，再利用 X 光影片顯影。
蛋白質轉渍法 (Western blot analysis)
HepG2 cells 經不同時間的乙醛處理後利用 250 μl sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM dithiothreitol, 0.1% bromophenol blue, pH 6.8)將細胞溶解，以超音波震盪器(Sonics and materials,Inc)160 W 震盪 10 秒擊破 細胞，之後在 4℃下以 12,000 xg 離心 5 分鐘，最後以 100℃煮沸 5 分鐘。定量 10 μg 的蛋白質以 10% SDS-polyacrylamide 蛋白質電泳，並以硝酸纖維膜轉印後
以blocking buffer (20 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 5% skim milk powder, pH 7.6) 阻斷非特異性的結合位。之後加入 anti-IKK, anti-IκB-α, anti-p65, anti-JNK, or anti-β-TrCP 的抗體 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)進行雜
合作用後，加入 peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody 以 chemiluminescence (ECL system, Amersham, Buckinghamshire, UK)呈色，再利用 X 光影片顯影。
腫瘤細胞轉移能力的測試 (Invasion assay)
細 胞 轉 移 測 試 是 分 析 腫 瘤 細 胞 是 否 具 有 破 壞 細 胞 外 基 質 的 能 力 ， 將 Matrigel-coated film insert (8-μm pore size)上層覆蓋一層 Matrigel matrix，再將 Matrigel-coated film insert 置 於 24-well invasion chambers (Becton-Dickinson Bioscience, Franklin Lakes, NJ)測定 (圖 4)，若腫瘤細胞具轉移能力則可破壞 matrix 轉移至下層。HepG2 cells (5×104) 與含或不含乙醛的 200 μl DMEM 混合 後加到 Matrigel invasion chambers 的上層，Invasion chamber 下層加入 500 μl DMEM，培養於含 5% CO2 的 370C 培養箱 24 小時後, 利用棉棒刮去 Insert chamber 上層的細胞，下層的細胞染色後利用 200x 顯微鏡計數細胞數目，以上 實驗為三次實驗的平均值±標準差。
統計分析
本研究的數據使用Excel XP (Microsoft)計算多次重複實驗中數據的平均值 與標準差，並利用Student’s t test 分析有無顯著差異存在。
Coomassie blue染色
透明(與背景的 藍色成對比)
圖 2. Gelatin zymography 流程圖
Gelatin Sample
MMP-9 將 Gelatin 水解
37℃ incubation
以電泳分離
MMP9p-wt MMP9p-NF -κB-CAT
MMP9p-AP-1-CAT
pGL3-basic PCR
MMP-9 promoter mutant (730 bp)
MMP9p-NF -κB mutant MMP9p-AP-1 mutant
圖 3. 架構MMP-9啟動子的冷光報導質體流程圖
MMP9p-NF-κB mutant
MMP9p-AP-1 mutant MMP9p-Wild type
圖 4. Matrigel 示意圖
Cells Insert
24-well plate Matrigel
matrix
8-μm pore
第三章 實驗結果
乙醛在HepG2 及 Chang liver cells 中可增加 MMP-9 的表現
腫瘤的侵襲與轉移須 MMP 的表現上升。為了探討乙醛可否藉由增加
MMP-9 的表現而造成腫瘤的轉移，我們利用 Zymographic analysis 觀察乙醛對於 MMP 表現的影響。Zymographic analysis 是利用 MMP 具水解 gelatin 的能力，於 是在 PAGE 加入 gelatin，若有 MMP 存在則可在 37 度培養 48 小時後將 gelatin
水解，被水解的部分則無法被coomassie blue 染色，再依照分子量得知是哪一種
MMP。圖 5 的結果顯示，乙醛在 HepG2 cells 能增強 92 kDa MMP-9 的表現，10 μM 的乙醛活化倍率最高，為 mock 組的 12.9 倍；而 100 μM 的乙醛活化倍率比 10 μM 低。另外乙醛也可在 Chang liver cells 中增加 MMP-9 的表現，但活化倍率
較低。這些結果證實了乙醛在HepG2 及 Chang liver cells 中可增強 MMP-9 的表 現。
乙醛可以增加MMP-9 mRNA 的表現量
為了了解乙醛增加MMP-9 的表現是否經由增加 MMP-9 mRNA 的量，我們
利用RT-PCR 觀察乙醛對於 MMP-9 mRNA 的影響。圖 6 是 RT-PCR 的結果，上 圖是MMP-9 mRNA 變化量，中圖以 GADPH 證實 RT-PCR 條件相同，下圖以 18S 及28s rRNA 當 internal control 證明 RNA 等量。活化倍率計算方式為未加乙醛的 MMP-9/GAPDH 比上加入乙醛的 MMP-9/GAPDH 的比值。從圖 6 的結果可得知
HepG2 cells 在處理乙醛 16 小時之後，MMP-9 mRNA 明顯增加，10 μM 的乙醛
活化倍率最高，為mock 組的 9.4 倍。這些結果證實了乙醛經由增加 MMP-9 基
因轉錄而增加MMP-9 的表現。
乙醛可促進NF-κB、AP-1 的活性
由於MMP-9 啟動子上含 AP-1 與 NF-κB 結合位(Sato and Seiki, 1993; Sato et al., 1993) ，於是我們利用冷光報導系統分析乙醛對於這兩個轉錄因子的影響。
結果顯示乙醛可活化NF-κB 的活性，最高活化倍率為 1.6 倍;而 AP-1 為 1.2 倍(圖 7)。NF-κB、AP-1 活化後會進入到細胞核中與特殊 DNA 序列結合，而增加下游 基因的表現。因為之前的實驗中，10 μM 乙醛活化 MMP-9 及上游轉錄因子 NF-κB、AP-1 的倍率最高，所以將之後實驗乙醛濃度定為 10 μM。為了確定乙醛
能夠活化NF-κB、AP-1 的活性，於是我們利用 EMSA 測定乙醛對於是否可增加
NF-κB、AP-1 進入細胞核中與 DNA 結合。圖 8、9 的結果顯示 10 μM 的乙醛可
增加細胞核中 NF-κB、AP-1 與 DNA 結合。隨著時間的增加，細胞核中 NF-κB
與DNA 結合越多，直到加入乙醛後的第 8 小時，可達到最高的活化倍率 (圖 8)。
而AP-1 與 DNA 的結合的量，加入乙醛後的 15～45 分鐘也會增加 (圖 9)。這些
結果證實了乙醛可增加NF-κB、AP-1 進入細胞核中與 DNA 結合。
乙醛可經由MMP-9啟動子上的NF-κB及 AP-1結合位調控MMP-9的表現
為了探討乙醛可否藉由促進 MMP-9 基因上游啟動子的活性而使轉錄作用
增加，我們利用MMP-9 啟動子的冷光報導試驗分析。首先利用 PCR 放大 MMP-9
基因啟動子的位置 -670 到+54，之後架接到 pGL3-Basic vector (圖 10A)。將架接 好的質體轉染到HepG2 cells，處理乙醛 24 小時之後以冷光測定 MMP-9 啟動子
的活性受影響之情形。圖10B 的結果顯示乙醛可誘發 MMP-9 啟動子的活性，約
為pGL3-Basic vector 的 5.2 倍。由於 MMP-9 啟動子上含 AP-1 與 NF-κB 結合位，
於是我們利用MMP-9 啟動子 NF-κB 或 AP-1 結合位的單點突變的冷光報導質體
分析乙醛對於這兩個轉錄因子的影響。圖10B 的結果顯示 NF-κB 或 AP-1 結合位
的突變可明顯的使乙醛所活化的MMP-9 啟動子的活性下降。由以上結果證明乙
醛可經由MMP-9 啟動子上的 NF-κB 及 AP-1 結合位調控 MMP-9 的表現。
乙醛磷酸化IκB 後使得 NF-κB 進入到細胞核中
接下來藉由蛋白質轉漬法往上推測乙醛活化上游的 NF-κB 訊息傳導路徑的位
置。NF-κB 原本會與 IκB 結合呈不活化而存在於細胞質中，若 IκB 被 IKK 磷酸
化後會與NF-κB 分離，此時 NF-κB 會活化進入到細胞核中影響基因的轉錄。我
們利用NF-κB 的次單位 p65 觀察 NF-κB 在細胞核質的比例。從圖 11 中可以看出 乙醛處理的細胞，p65 進入到細胞核中增加。由於 IκB 的磷酸化和分解為 NF-κB
活化的主要訊息傳導路徑，所以接下來想往上探討的是乙醛是否會經由增加IκB
的磷酸化和分解而活化NF-κB。從圖 11 的結果可知 IκB 磷酸化的量在乙醛加入
的 45 分鐘到 24 小時皆有明顯的上升。這些結果證明了乙醛磷酸化 IκB 後使得
NF-κB 進入到細胞核中。
乙醛可能可以經由JNK 及 β-TrCP 訊息傳導路徑加速磷酸化的 IκB 分解
在之前的研究中 我們利用蛋白質轉漬法證實了乙醛可以經由 IκB 的磷酸化
和分解進而活化NF-κB。然而加入乙醛後 IKK 的活性並無明顯改變， 許多訊息
傳導路徑都能調控NF-κB 的活性，包含 ras/raf-1、 MAP kinases 或 Akt (Beaupre et al., 1999; Madrid et al., 2001; Kurland et al., 2003; Nawata t al., 2003) 。近年來有
報告指出，JNK 可以經由增加 β-TrCP 使得 IκB 磷酸化加速分解而讓 NF-κB 持續 活化(Spiegelman et al., 2001)。從圖 12 中蛋白質轉漬法的結果可得知經乙醛處理
的細胞JNK 及 β-TrCP 的量明顯的升高，這些結果證明了乙醛可能可以經由 JNK
及β-TrCP 而增加 MMP-9 基因的表現。
乙醛可以經由JNK 和 p38 訊息傳導路徑活化 AP-1 的活性
因為AP-1 的活性受到 MAP kinases 的調控 (Karin et al., 1997), 所以接下來
我們利用蛋白質轉漬法觀察乙醛對於MAP kinases 的影響，從圖 12 結果中可得
知乙醛對於 JNK, p38, and ERK 蛋白質的量影響不大。而乙醛可刺激 JNK 及 p38
的磷酸化但並無法誘發ERK 的磷酸化增加，這些結果證明了乙醛可能可以經由 JNK 及 p38 活化 AP-1。
乙醛可促進腫瘤細胞轉移
腫瘤細胞轉移需增加MMP-9的表現 (Nelson et al., 2000)。 我們在之前的研究中 已經證實乙醛可增加MMP-9的表現，所以接下來我們想要測試乙醛是否經由活 化MMP-9而可增加腫瘤細胞轉移。如圖 13所示,利用Matrigel-coated filter測試，
乙醛可促進細胞的轉移能力約為16倍。這些結果證明了乙醛可能可以經由活化 MMP-9而增加腫瘤細胞的轉移。
第四章 討論
肝臟是酒精氧化的主要部位，人體內只有百分之十到十五的酒精在其他組
織氧化。在肝臟中酒精被酒精去氫酶氧化成乙醛，此反應需要NAD 當輔酶；由
織氧化。在肝臟中酒精被酒精去氫酶氧化成乙醛，此反應需要NAD 當輔酶；由