肝臟是酒精氧化的主要部位，人體內只有百分之十到十五的酒精在其他組
織氧化。在肝臟中酒精被酒精去氫酶氧化成乙醛，此反應需要NAD 當輔酶；由
於細胞內 NAD 的含量有限，因此代謝以零級反應進行，亦即每小時代謝 7-10
公克酒精。人體肝細胞內的微粒體含有特殊的酵素稱細胞色素 p450 還原酵素
(cytochrome p450 reductase)來完成藥物在體內的代謝過程。微粒體 Cytochrome p-450 還原酵素中有一個族群(特別是 cytochrome p450 2E1 酵素)可以將乙醛進 一步氧化產生各種自由基。在慢性酒精中毒的過程中,此酵素的活性會大大的提 昇,因而產生大量自由基傷害肝細胞並促進肝臟傷害(Morgan et al., 2004)。
酒精造成的疾病，其發生和演變有多種基因參與，包括基因與基因之間及 基因與環境之間交互影響。酒精去氫酶和乙醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase，
ALDH)是人體主要的酒精代謝酶系統，酒精的藥理作用及細胞毒性和酒精及代謝
產物乙醛濃度相關。ADH2 和 ALDH2 對偶基因的功能多形性影響乙醇和乙醛的 藥物動力學及對腦、心臟血管、肝、上下消化道的藥物效力學，進而影響人類的 飲酒行為、酒癮和酒精器官傷害的發生。酒精在人體內分解，90-95% 以上經由 氧化途徑，包括酒精去氫酶、細胞色素、過氧化酶(catalase) 和乙醛去氫酶，其 中以酒精去氫酶和乙醛去氫酶途徑為主((Yin et al., 1999)。ADH 和 ALDH 均呈複
雜的酵素家族 (family)，其對偶同功酶具種族差異。人類乙醛去氫酶巨族
間，他們的基質專一性差異甚大。乙醛作為基質的 ALDH1 和 ALDH2 屬低 Km 類，ALDH3 則屬高 Km 類(Yin et al., 1995)。東方人族群約 50% 具 ALDH2 變異
型對偶基因，它位於12 號染色體 q24 的位置，在表現序列 12 有一點突變，造成
487 位置麩胺酸換成離胺酸，導致酶失去活性(Yin and Agarwal ,2001)。ALDH2 變異型在其他族群尚未發現，所以是東方人特有的對偶基因。變異型 ALDH2 在
飲酒後2 小時，血中乙醛仍持續高量堆積，造成心搏持續加速，心輸出量持續增
加，舒張壓持續下降，全身血管阻力持續降低，面動脈、頸總動脈和內頸動脈血 流速率持續降低，同時持續產生顯著的整體不舒適的感覺。因此即使變異型 ALDH2 飲少量酒，仍會造成血液中乙醛持續堆積，引發強烈心臟血管反應，產
生整體不舒適感覺(Peng et al., 1999)。所以我們認為乙醛對於東方人造成的肝臟 傷害可能比其他人種嚴重。
乙醛與肝癌的發展有關，有研究指出肝癌轉移病患的MMP-9 基因的表現高
於正常人(Arii et al., 1996)。在這個研究當中我們探討的是乙醛與 MMP-9 基因表
現的相關性，我們的數據顯示出乙醛可以經由轉錄因子 AP-1 與 NF-κB 調控
MMP-9 的轉錄，進而造成 MMP-9 表現增加。由於 MMP-9 會分解與腫瘤轉移相 關的基底膜主要成分-第四型膠原蛋白 (Nelson et al., 2000)，所以我們認為乙醛可 能參與腫瘤的轉移與發展的步驟。
由於MMP 會破壞基底膜，所以 MMP 的表現增加可能與腫瘤的侵襲與轉移
有關。MMP-9 在肝癌的表現量最高，所以 MMP-9 可能與肝癌的轉移有關。許多
肝病誘發物包含 B 型肝炎病毒、生長因子、TPA (12-O-tetradecanoylphorbol -13-acetate)等都會造成肝癌的惡化，近年來的研究證實了這些刺激物會經由不同
的訊息傳導路徑增加MMP-9 的表現而與腫瘤的轉移有關。B 型肝炎病毒的 X 蛋
白會經由 PI-3K/AKT 及 ERK 路徑活化 AP-1 與 NF-κB 增加 MMP-9 的表現 (Chung et al., 2004)。另外 TGF-β 也可藉由 p38 傳導路徑活化 MMP-2 及 MMP-9 的表現 (Kim et al., 2004)。而 TPA 主要是經由 PKC 活化下游的 Ras/ERK 路徑誘 發MMP-9 基因表現增加 (Liu et al., 2002)。在這個研究當中我們首次証實乙醛可 以經由 IκB 、JNK 及 p38 訊息傳導路徑活化轉錄因子 AP-1 與 NF-κB 而增加 MMP-9 的表現。
MMP-9 啟動子上含 AP-1、NF-κB、SP-1 及 AP-2 轉錄因子結合的位置(Sato and Seiki, 1993)，近年來有研究指出這些轉錄因子能夠增加 MMP-9 的表現，例 如v-src 可經由 AP-1 及 GT box 刺激 MMP-9 表現(Sato et al., 1993)。而在卵巢癌 細胞則是經MEK 訊息傳導路徑調控其基因表現(Gum et al., 1996)。另外也有研究 利用基因轉殖老鼠證明AP-1、NF-κB、SP-1 是調控 MMP-9 表現及受傷害的組織 重組所需(Mohan et al., 1998)。所以乙醛也可能影響其他訊息傳導路徑以及增加 其他基因表現而促進腫瘤轉移，在未來希望能夠結合基因晶片分析以及動物實驗
更加深入的了解乙醛促進肝癌轉移的分子機轉。
大多數的ROS (reactive oxygen species)也可經由增加 MMP 的表現而造成腫 瘤細胞的侵襲與轉移(Shi et al., 2004)，例如 H2O2及XXO(superoxide-generating system of xanthine plus xanthineoxidase)可以經促進 MMP 轉錄及後轉錄作用增加 MMP 及 pro-MMP 的表現，而與腫瘤的轉移有關 (Siwik et al., 2001)。在這個研
究當中，我們證實酒精的氧化代謝產物乙醛經由AP-1 及 NF-κB 增加 MMP-9 的
轉錄，這些結果證明了乙醛也與腫瘤的轉移相關。
未受刺激的細胞，NF-κB 與其抑制蛋白質 IκB 結合形成不活化態，而存在 於細胞質當中，但是如果IKK 將 IκB 磷酸化，接下來 JNK 會活化 β-TrCP 使其與 磷酸化的IκB 結合，將其送到 26S proteasome 進行分解，而 IκB 與 NF-κB 解離 之後，NF-κB 即可持續活化進入到細胞核中與基因上游的 NF-κB 的核苷酸序列 結合，使下游基因的表現量增加 (Karin and Ben-Neriah, 2000)。在這個研究當中，
我們利用蛋白質轉渍法證實了乙醛經由JNK/β-TrCP 將 IκB 磷酸化及分解，而增
加 MMP-9 的表現。在這個研究中我們證實乙醛除了活化 NF-κB 以外也可促進
AP-1 的活性，這是因為 JNK 及 p38 訊息傳導路徑皆會活化 AP-1 的活性 (Karin et al., 1997)，所以我們認為乙醛是透過 JNK 及 p38 訊息傳導路徑活化 NF-κB 及 AP-1。總而言之，我們的結果證明了乙醛經由 IκB、JNK/β-TrCP 及 p38 路徑活
化NF-κB 與 AP-1 而使 MMP-9 表現增加。
綜合以上結果，我們證實乙醛與腫瘤的轉移有關。而機轉為乙醛可以經由 IκB、JNK 及 p38 活化轉錄因子 NF-κB 與 AP-1 進入細胞核中活化 MMP-9 基因 表現(圖 14)。由於我們提供了乙醛與腫瘤的轉移的相關性以及作用之訊息傳導 路徑，這可能可以成為抗腫瘤轉移藥物的新標的。
(A) HepG2 cells
(B) Chang liver cells
圖 5. 利用 gelatin zymography 證實乙醛在 HepG2 及 Chang liver cells 中可誘發 MMP-9 的活性
HepG2 與 Chang liver cells 培養於含 10% FBS 的 DMEM 中，之後移去培養液加 入以DMEM 稀釋不同濃度的乙醛。 24 小時後收集培養液以 gelatin zymography
分析MMP 的活性。箭頭所指的是 92 kDa 的 MMP-9，活化倍率的計算方式是比
較未處理藥物與處理藥物後MMP-9 band 的密度。
0 1 10 100
Activation fold 1 10.3 12.9 12.2
92 kDa Acetaldehyde (μM)
Activation fold 1 1.5 1.4 1.3 0 1 10 100
Acetaldehyde (μM)
92 kDa
MMP-9 mRNA
圖 6. 利用 RT-PCR 證實乙醛可以增加 MMP-9 mRNA 的表現量
HepG2 於 25-cm2 flasks 中培養，加入不同濃度的乙醛 16 小時後，萃取其 RNA，
取 1 μg 的 RNA 進行反轉錄。經反轉錄產生的 cDNAs 產物以人類 MMP-9 或 GAPDH 基因專一性的引子進行 PCR。PCR 的結果以 1% agarose gels 偵測後以 ethidium bromide 染色。活化倍率的計算方式是比較未處理藥物與處理藥物後 MMP-9 band 的密度。
Activation fold 1 1.4 9.4 2.9
GAPDH mRNA 28S rRNA 18S rRNA 0 1 10 100 (μM)
轉錄因子的活性。HepG2 cells 穩定性轉染 pNF-κB-Luc 或 pAP-1-Luc，加入不 同濃度的乙醛，8 小時後測量其冷光活性。單位以 relative luciferase unit (RLU)
表示。活化倍率的計算方式是以乙醛處理細胞的RLU 除以未受乙醛處理細胞的
RLU。以上實驗為三次實驗的平均值±標準差。**表示 p<0.01。
**
** **
**
圖 8. 乙醛可促進 NF-κB 的活性
HepG2 cells 經乙醛處理不同時間後，收集細胞核的萃取液。之後加入會與 NF-κB
結合的biotin 標定的雙股核苷酸序列進行反應。
Mock 15 min 45 min 1 h 8 h 24 h
NF- κB- DNA complex
Free probe
圖 9. 乙醛可促進 AP-1 的活性
HepG2 cells 經乙醛處理不同時間後，收集細胞核的萃取液。之後加入會與 AP-1 biotin 標定的雙股核苷酸序列進行反應。
Mock 15 min 45 min 1 h 8 h 24 h
AP-1-DNA complex
Free probe
(A)
pGL3-basic wt NF-κB mt AP-1 mt
Relative luciferase activity
圖 10. 乙醛可以活化 MMP-9 啟動子的轉錄
(A) Wild-type (wt) 或 NF-κB 結合位 (NF-κB mt) 或 AP-1 結合位 (AP-1 mt)突變
的MMP-9 啟動子的示意圖，轉錄因子的結合位如圖所示。(B) MMP-9 啟動子活
性。HepG2 cells 暫時性轉染 pGL3-basic 或 MMP-9 報導質體後，加入 10 μM 的乙醛。單位以 relative luciferase unit (RLU)表示。活化倍率的計算方式是以 MMP-9 報導質體的 RLU 除以 pGL3-basic 的 RLU。以上實驗為三次實驗的平均
p65 (cyto)
p65 (nu)
IκB-α
phospho-IκB-α
IKK-α
IKK-β
phospho -IKK-α/β
圖 11. 乙醛將 IκB 磷酸化後使得 NF-κB 進入到細胞核中
HepG2 cells 經 10 µM 的乙醛處理不同時間後，以蛋白質轉漬法偵測細胞萃取液
中 p65、IκB、IκB 磷酸化、IKK 及 IKK 磷酸化的表現量。以上為三次實驗呈現
相似的結果。
Mock 15 min 45 min 1 h 8 h 24 h
1 1 0.9 1 0.9 0.9
1 0.9 1.3 1.2 0.9 0.9
1 1.1 0.9 1. 1.1 0.6
1 1.1 2.6 2 2.8 2.1
1 0.9 0.8 0.9 0.9 0.9
1 1 1.1 0.8 0.9 1.3
1 0.9 1 1.2 0.9 1.2
1 1 1 1.1 1 1
1 1.1 1.4 1.7 2 4
1 0.9 0.8 0.8 0.9 1
1 1 1 1 0.8 1.2
圖 12. 乙醛可以經由 JNK/β-TrCP 和 p38 訊息傳導路徑活化 NF-κB 和 AP-1 的 活性
HepG2 cells 經 10 µM 的乙醛處理不同時間後，以蛋白質轉漬法偵測細胞萃取液 中JNKs、JNKs 磷酸化、β-TrCP、p38、p38 磷酸化、ERKs 及 ERKs 磷酸化的表
Mock 15 min 45 min 1 h 8 h 24 h
JNKs
β-TrCP
phospho -JNKs
1 1.2 1.2 1 0.9 0.9
1 1.7 1.5 1.4 1.6 1.2
1 2.4 3.5 3 3.3 3.1
p38
phospho- p38
ERKs
phospho-ERKs
-5 0 5 10 15 20 25
Mock Acetaldehyde
Invasion fold
圖 13. 乙醛可造成腫瘤細胞轉移
HepG2 cells (5×104) 與含或不含乙醛的 200 μl DMEM 混合後加到 Matrigel invasion chambers 的上層。培養 24 小時後, 利用棉棒刮去 Insert chamber 上層細
胞，下層的細胞染色後利用200x 顯微鏡計數細胞數目。(A) 轉移的細胞顯微鏡
下的型態 (B) Invasion assay 的柱狀圖。細胞轉移倍率的計算方式是以加入乙醛 的細胞轉移數目除以未加乙醛的細胞轉移數目。以上實驗為三次實驗的平均值±
標準差。**表示 p<0.01。
Mock Acetaldehyde (10 μM)
**
p50 p65 AP-1 IκB
IκB p
Nucleus
CytosolNF-κB activation
ß-TrCP IKK
p
JNK
IκB ubiquitination and degradation p50 p65
Transcriptional activation Acetaldehyde
AP-1 activation p38
MMP-9 gene
圖 14. 乙醛增加 MMP-9 基因表現之分子機轉
乙醛可以經由IκB、JNK 及 p38 訊息傳導路徑同時活化轉錄因子 NF-κB 與 AP-1
進入細胞核中與MMP-9 基因上游的啟動子結合而增加 MMP-9 基因表現。
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