冷凍蛋黃萃取 IgY 的過程

蛋黃冷凍過程中，因含量豐富的 LDL 分子聚合，使得蛋黃在解 凍後呈現凝膠狀態（圖一 A），不易溶於酸水、醋酸鈉溶液或 PBS 等 水性溶液中（圖一 B），經攪拌子進行充分攪拌後，方能使蛋黃與溶 液混合均勻，再藉離心可收集到呈黃濁狀的上清液（圖一 C），推測 其中的膽固醇、脂蛋白、類胡蘿蔔素等脂質並未完全去除(Smith et al., 1966; Awad et al., 1997)，因此我們參考以氯仿萃取蛋黃 IgY 的文獻 (Pour-Amir et al., 2000)，選擇添加與蛋黃粗萃液等體積的氯仿，再藉 離心使之和水溶性物質分離，即可見在上方呈清澈貌的水層（圖一 D），

此即為冷凍蛋黃的粗萃液，下層液則是溶解脂溶性物質後呈黃色的氯 仿層，而在水層與氯仿層中間則有一層淡黃色脂質薄膜存在，由此可 見氯仿具有去除冷凍蛋黃粗萃液中的脂質之功效。

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圖一、冷凍蛋黃的粗萃取過程示意圖。

蛋黃冷凍過程中發生凝膠反應，解凍後的蛋黃則呈膏狀（A），放入 PBS 中不易與之混合均勻（B），經過攪拌與離心的步驟，可收得十 分黃濁的上清液（C），添加氯仿（使用濃度為 33％）後再進行離心 即可獲得清澈透明的上清液（D），此即為冷凍蛋黃的粗萃液。

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2. 氯仿使用量與蛋黃粗萃液的蛋白質分析

由於氯仿為具有毒性的化合物，使用過程中容易對操作者引起致 癌可能，同時處理不當也會對環境產生污染，因此首先須測試不同氯 仿用量對去除脂質的影響，以求能在較少氯仿用量的操作下進行 IgY 萃取。Pour-Amir et al. (2000) 將蛋黃稀釋後進行離心，回收蛋黃粗萃 液，再添加與粗萃液等體積的氯仿進行去脂，本實驗則選擇將萃取液 與氯仿的體積比設定為 1:0.5、1:1、1:2。結果發現三種氯仿使用量皆 可透過離心回收到清澈的蛋黃粗萃液，具有相當的去脂效果，蛋白質 與 IgY 的定量分析（表一）則顯示三種粗萃液中的 IgY 含量並無顯著 差異，每毫升蛋黃能萃得的 IgY 為 9.4～9.8 mg；每毫升蛋黃能萃取 獲得的蛋白質含量則在 27.3～29.1 mg 之間，統計上亦無明顯差別。

取等量蛋白質進行 SDS-PAGE 及 CBB 染色（圖二），可發現各組萃 取液中的蛋白質成分皆相似，含量亦呈現一致，因此將蛋黃稀釋液與 氯仿的體積比設定為 1:0.5，即氯仿濃度為 33％，已足夠達到良好的 去脂效果，幫助獲得均質化的蛋黃粗萃液，其中的 IgY 蛋白質成分也 與利用醋酸鈉萃取法從液態蛋黃製備的粗萃液相當（請參考第二章之 內容）。

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表一、不同氯仿使用量對蛋黃成分萃取效果的比較。

表中數值為三次重複實驗結果的平均值與標準差。同一列數值中上標的 英文字母相同時，代表各處理間無顯著差異（p＞0.05），若上標的英文 字母相異時，則表各處理間具有顯著差異（p＜0.05）。

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圖二、氯仿處理之蛋黃粗萃取液的電泳分析結果。

將氯仿處理過的三種蛋黃粗萃取液，各取約 8 g 蛋白質進行 12％

SDS-PAGE 與 CBB 染色的結果。圖右側分別標記 IgY 的 H chain（70 kDa）及 L chain（26 kDa）之位置。MW 則為蛋白質分子量標準品

（Bioman，PL01425）。

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3. 蛋黃粗萃液的硫酸銨鹽析沉澱測試

收集冷凍蛋黃的粗萃液後，添加不同飽和度（30％、50％及 60

％）的硫酸銨鹽析沉澱蛋白質，再分析其中的 IgY 與蛋白質含量變化 情形。表二的結果顯示，添加硫酸銨至粗萃液中的量越多，總蛋白質

（total protein）及 IgY 被沉澱的量亦隨之增加，並且兩者間非以等比 例的形式變化：當添加 30％飽和度的硫酸銨時，10 mL 蛋黃粗萃液可 沉澱出 4.2 mg 的蛋白質，其中 3.8 mg 為 IgY，純度高達 91％，然而 回收率僅 48％；在 50％硫酸銨飽和度的條件下，同體積的蛋黃粗萃 液則可析出 12.4 mg 的蛋白質，其中含 7.3 mg IgY，回收率則提高到 89％，但純度下降至 59％。

從不同硫酸銨飽和度鹽析沉澱的樣品中，取等量蛋白質進行 SDS-PAGE 及 CBB 染色，結果（圖三）可見隨著硫酸銨飽和度增加，

沉澱樣品中的-、- livetin 與其他蛋白質的實際含量亦逐漸增加，使 得 IgY 的相對含量逐漸遞減。

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表二、蛋黃粗萃液的鹽析沉澱結果。

表中數值為三次實驗結果的平均值與標準差。統計處理時首先進行 ANOVA 分析，若組間具有差異，則再進行 t-test 交叉分析組間的差 異情形。同一列內的上標英文字母相同時，代表各處理間無顯著差異

（p＞0.05）；相異時則表各處理間具有顯著差異（p＜0.05）。

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圖三、不同鹽析產物的電泳分析結果。

將冷凍蛋黃的粗萃液（C）及經不同硫酸銨飽和度（30％～60％）沉 澱的樣品，各取 3 g 蛋白質進行 12％SDS-PAGE 與 CBB 染色。圖右 標示出蛋黃中特定蛋白質的分佈位置。MW 為蛋白質分子量標準品

（Bioman，PREP1025）。

- 69 - 造成的現象(Wakamatu et al., 1983)。前人的研究顯示，-6℃可能為蛋 黃膠體現象產生的臨界溫度，低於-6℃將促進蛋黃的黏度上升，而當

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et al., 1992; Pour-Amir et al., 2000)，因此我們嘗試利用氯仿去除冷凍 蛋黃粗萃液中的脂質成分，遂於由 PBS 製成的蛋黃萃取液中添加氯 仿，離心後可見脂質溶解在氯仿內而呈黃色貌（圖一 D），上方的蛋 黃粗萃液則顯得清澈，因此判斷原本使蛋黃粗萃液呈現黃濁的脂質成 份已大致去除，粗萃液樣品將可用於後續分析與純化。

前人在萃取蛋黃 IgY 方面，在蛋黃粗萃液中添加等體積的氯仿已 知可獲得良好的去脂效果(Pour-Amir et al., 2000)，而在本實驗中，尚 不知氯仿對冷凍蛋黃粗萃液的去脂效果，於是我們將蛋黃粗萃液與氯

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本論文第四章）。

蛋黃粗萃液中含有為數眾多的蛋白質種類，除了佔三成左右的 IgY 外，還有 ovotransferrin（80 kDa）、α- livetin（65 kDa）、β- livetin

（YGP40，35 kDa、YGP42，40 kDa）及 truncated serum albumin（Δ serum albumin，45 kDa）等等(Yamamura et al., 1995; Nilsson et al., 2006)，隨 著硫酸銨添加量增加，IgY 的回收量也跟著增加，但其他非目標蛋白

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空間有限，因此應盡可能減少存放雞蛋樣品所需的體積。一顆雞蛋的 組成中，蛋白佔 63％，而蛋黃佔 27.5％(Kovacs-Nolan et al., 2005)，

我們認為將蛋黃與蛋白分離後，另以容器儲存，將能有效減少對儲存 空間的需求，同時也可以減少雞蛋互相碰撞而損壞的風險，再者也可 減少暴露在開放環境中，雞蛋受到細菌，如沙門氏菌感染的機會；目 前 IgY 抗體的萃取樣品在－20℃或更低溫的環境中保存，將能維持抗 體活性達 7 個月以上(da Silva et al., 2010)，因此將含有 IgY 抗體的蛋 黃儲存於低溫環境中也可有效保持其蛋白質活性；利用冷凍保存含有 有效抗體的蛋黃液，能讓 IgY 抗體生產單位隨時因應需求而將含目標 抗體的蛋黃解凍，減少純化多餘蛋黃的人力及成本支出與降低雞蛋囤 積之壓力；蛋黃解凍後搭配本研究發展的冷凍蛋黃萃取方法也僅需 2.5 小時即可完成去脂及硫酸銨的沉澱步驟，將能促進實驗室對蛋黃 IgY 的利用與提升產業界對純化抗體時機的彈性。

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圖四、冷凍蛋黃的 IgY 萃取流程圖。

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第四章 由雞隻蛋黃生產小鼠免疫球蛋白之多株抗體

（Polyclonal antibody production in chickens immunized

with mouse IgM）

第一節 摘要

本研究取小鼠的 IgM 對雞隻進行免疫注射，再收集雞蛋生產對 應的多株抗體。經測試不同的抗原注射劑量，發現 300 g 的抗原劑 量最為恰當，蛋黃中專一性抗體的效價明顯高於其他注射組。本實驗 的免疫注射流程造成有效雞蛋的收集時間約為 38 天，並可透過激活 注射再加倍延長收集時間。本研究所生產的 IgY 可應用於 ELISA 及 免疫轉漬實驗；在抗體的專一性部分，除了可辨識小鼠的 IgM 及 IgG 各亞型的重鏈之外，亦可與小鼠的輕鏈作用，但幾乎不會與兔的 IgG 反應，更不會對小鼠的 IgA 重鏈、

輕鏈及山羊的 IgG 發生交叉反應。

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第二節 緒言

1975 年，Kohler 與 Milstein 利用小鼠的 B 細胞（B cell）與瘤細 胞融合（myloma cell），保留兩者的優點，製作出可不斷增生並持續 分泌抗體的融合瘤細胞（hybridoma cell）(Kohler et al., 1975)，經篩選 並保留單一種細胞株，其分泌的抗體即為單株抗體：單一類型免疫球 蛋白，僅能辨識抗原上的單一種表位（epitope），高度專一性及均質 化的特質也較能提升結果的一致性，已被廣泛應用於免疫實驗偵測、

醫學診斷、疾病預防及治療等等(Lipman et al., 2005; Velusamy et al., 2010)，近年也已使用單株抗體檢測癌細胞，並發展出抗體標靶療法 治療癌症(Chiarella, 2011; Yang et al., 2011)。

單株抗體的應用廣泛，通常在使用上都需要搭配多株抗體以呈現 或放大單株抗體的辨識結果。多株抗體主要由中、大體型哺乳類動物 的血清為生產來源(Leenaars et al., 1999)，然而並不利於用來生產對應 哺乳動物保守性蛋白質(conserved protein)的抗體，針對此項缺點，可 利用與哺乳類親緣差距（phylogenetic distance）較大的雞隻生產相對 應的抗體(Gassmann et al., 1990; Gerl et al., 1996; Gasparyan, 2005; Xu et al., 2011)，以減少偽陽性結果的發生。目前已有文獻指出雞隻 IgY 對抗原的敏感度較哺乳類抗體為佳(Danielpour et al., 1995; Doth et al., 1996)，更適用於免疫組織染色分析(Al-Haddad et al., 1999; Di Lonardo

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et al., 2001)，同時受背景值的干擾較少(Kunz et al., 1991; Ohnishi et al., 2000; Cipolla et al., 2001)，因此在呈現小鼠單株抗體之辨識結果方面 的應用，IgY 抗體是較哺乳類 IgG 抗體更為合適的工具。

免疫注射雞隻所採用的抗原、佐劑、注射方式以及個體本身的條 件皆會影響免疫反應的結果(Schade, R. et al., 2005)，適當的免疫注射 策略方能較為有效地促使動物生產抗體，當母雞接受特定抗原後，激 起與抗原對應的 IgY 大量表現，經由血液循環輸送到卵巢內正在發育 的卵母細胞(Rose et al., 1981)，再與膜上的受器結合並送入蛋黃內儲 存(Tressler et al., 1987)，因此將可直接以收集雞蛋的方式收集抗體，

較一般哺乳動物的採血方式更為簡便、穩定，同時也更符合提升實驗 動物福祉的要求(Chalghoumi et al., 2009)。正常情況下，一隻雞每月 可產超過 25 顆蛋(Pauly et al., 2011)，每顆蛋黃的 IgY 產量可超過 100 mg (Schade, R. et al., 2005)，其中對應特定抗原的專一性 IgY 約佔 0.5

～10％(Schade, R. et al., 1994; Hansen et al., 1998; Li et al., 1998;

Schade, R. et al., 2005; Paul et al., 2007; Qu et al., 2011)。由於 IgY 在蛋 黃中的含量豐富，因此一隻雞的抗體年產量可高達一隻兔的十數百

Schade, R. et al., 2005; Paul et al., 2007; Qu et al., 2011)。由於 IgY 在蛋 黃中的含量豐富，因此一隻雞的抗體年產量可高達一隻兔的十數百