2-1 實驗材料
29 個於彰化基督教醫院自 29 位肺鱗狀上皮細胞癌患者手術 下來的標本，均包含有癌症部分及鄰近非癌組織，此樣本群均由 組織學証實並經由病理醫師確定診斷。組織樣本取下後均立即冷 凍並眝存於液態氮中直到進行萃取 DNA 和 RNA 為止。
臨床上這 29 個病人中有 2 位女性，27 位男性，年齡分佈為 41 歲到 77 歲，平均年齡為 62 歲。臨床分期為：4 位為第一 B 期，3 位為第二 A 期，7 位為第二 B 期，第三 A 期則有 15 位病人。
2-2 萃取 DNA
病理組織取下後，放入 eppendorf tube 中，加 100ml extraction buffer 及 2μL proteinase K（10μg/ml），在 65
℃作用 4 小時，加入 40μL potassium acetate，vortex 混合均 勻，置於冰上 1 小時後離心 12000rpm，10 分鐘，4℃，小心地取 上清液至新的 eppendorf tube，加入 0.7 倍體積的
isopropanol，緩和的搖晃數下後，離心 12000rpm，10 分鐘 4℃，
倒掉上清液，以 70% alcohol 清洗沈澱物，此清洗步驟重覆三次 晾乾後，加入 20μL 無菌的 ddH2O 溶解，存於 4℃備用[29]。
2-3 萃取 RNA
RNA 萃取為使用 Commercial kit（RNA-BeeTM，Tel-Test，Inc，
Texas, USA），萃取步驟完成後將其貯存於 pellet 中並冷藏於-70
℃的環境中備用。
2-4 同步定量反轉錄聚合酶連鎖反應（Real-time quantitative RT-PCR）
利用 9 個晝夜節律基因（PER1，PER2，PER3，CRY1，CRY2，
CLOCR，BMAL1，CKIε和 Timeless）的 mRNA 序列，我們使用 primer Express software（Applied Biosystems，Forster City，CA）
來設計 forward 和 reverse primers 及 TaqMan Probes，TaqMan Probes 合成時並標示以不同的螢光染料（Applied
Biosystems）。forward primers，reverse primers 及 probes 的序列，均表列於附表 1 中。
在 Real-time qRT-PCR 的實驗裡，我們是以
glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）基因的 表現量來作為內部控制值（Internel Control），在癌組織及配 對非癌組織中，9 種晝夜節律基因均以 GAPDH 為內部控制值，並 以 PCR 回數閥值（CT）差分別得到相對回數閥值（△CT），接著 再比較癌組織中晝夜節律基因之△CT 和非癌組織中晝夜節律基
因的△CT 得到△△CT，從而獲得晝夜節律基因於組織間的相對 表現量（2-△△CT）。
所有的 Real-time qRT-PCR 反應均是在 ABI-7700 的 Sequence detector（Applied Biosystems）中執行，並使用 TaqMan EZ RT-PCR core kit（Applied Biosystems）；在 25μL 的終容積中含有 40nM 的 primer，200nM 的 probe，300μM 的 deoxynucleoside triphosphate（dNTP），3mM 的乙酸錳，2.5U rTth DNA polymerase 和 1 倍的 PCR 緩衝液，整個 PCR 反應回數 設定為反轉錄反應，50℃，2 分鐘，接著為 60℃，30 分鐘，再 來是 95℃，5 分鐘，再行以 40 回的 PCR 反應（設定為 94℃，20 秒，62℃，1 分鐘）。
2-5 甲基化特異性聚合酶連鎖反應（Methylation-specific PCR，MS-PCR）
所有樣本的萃取 DNA 均先以 Sodium bisulfite 處理過，作 MS-PCR 所需的甲基化特異性及非甲基化特異性的 Primers 序列 列於附表 2，執行 MS-PCR 的方法如下：4μg 的 DNA 於 40μL 的 H2O 中並以 10μL 的 1M NaOH 在 37℃中，10 分鐘，進行 denature，
接著於 10mM hydroquinone 30μL 和 520μL 的 1.5M Sodium bisulfite 在 50℃下放置 16 小時進行修飾(Modification)。修
飾後的 DNA 樣本置於 Wizard DNA Purification kit（Promega，
Madison，WI，USA）並以 100μL H2O（預溫至 65-70℃）稀釋，
稀釋液中再加入 50μL 的 1M NaOH 並於室溫中置放 5 分鐘，接著 以 150μL 100% isopropanol 進行沈澱，並以 70% ethanol 清 洗後，再加入 45μL 的 H2O 中。此製備液接著行 PCR 反應，以製 備液加入 1 倍的 PCR 緩衝液，1m MgCl2，100μg primer，0.2mM dNTP，2.5U Taq Polymerase，於 Thermal cycler 上跑 35 回 PCR 反應，每一回包括有 94℃，1 分鐘行 denature，60℃，1 分鐘行 methylated 或 unmethylated primers anneal，72℃，1 分鐘行 extension，72℃，5 分鐘行 final extension。35 回後，PCR 產物置於 3.5%瓊膠上泳反應，並以 ethidium bromide 染色，並 在 UV 光下進行判讀。
CpG methylase（SssI）可以使所有的 Cytosine 甲基化，所 以拿來當作甲基化特異性 primer 的 positive control，從正常 人抽血的檢體因為在晝夜節律因中沒有異常甲基化，可作為非甲 基化特異性 primer 的 positive control，沒有經過 sodium bisulfite 處理過的組織樣本（包含癌組織及非癌組織）則作為 本反應的 Negative Control 組。
2-6 免疫組織化學研究（Immunohistochemistry study）
先將置於 poly-1-lysine 包圍的 slide 中石蠟包埋的檢體行 脫臘步驟，玻片置於甲醛中及 3% H2O2後，以階段性酒精及 PBS 來 re-hydrate，再置放於 10mM citrate buffer 中，並於 PBS 中加熱至 100℃，20 分鐘，加入晝夜節律基因蛋白（PER1，PER2，
PER3，CRY1，CRY2，CLOCK，BMAL1，CKIε及 TIMELESS）的特殊 抗體（Santa Cruz Biotechnology，CA，USA）後於室溫置放 20 分鐘，再將玻片取出，以 PBS 仔細的清洗 3 次後，置入 HRP/Fab Polymer 中 30 分鐘，經此步驟後，我們可以 3，
3’-diamino-benzidine tetrahydrochloride 來觀察組織玻片 中 peroxidase 的 activity，另外再以 Hematoxylin 染色當作 Counterstain，完成這些步驟後，加阿拉伯膠封片，以斜角 45 度放上蓋玻片，於室溫待膠乾後，以顯微鏡觀察並拍照紀錄。
2-7 統計方法
以 Microsoft Excel 2000 進行資料建檔，SPSS for windows Release 9.0（SPSS，Chicago，IL）進行統計分析，以平均值及 標準差，描述癌組織及非癌組織之間，Promoter 甲基化個數的 差異，並以 t Test 檢定， P 值小於 0.05 為顯著性差異。