(1).實驗耗材：
15cm 離心管、50cm 離心管，15cm dish，blue tip、yellow tip、
micro tip，1.5ml tubes、0.2ml PCR tubes ( Flat Caps )、0.2ml Q-PCR 專 用 tubes ( PCR Strip with attached Optically Clear Cap Low Profile )、96 孔培養盤。
(2).實驗相關試劑：
(A).DNase I ： Deoxyribonuclease I 20000U(251U/ μ L ) ； 廠 牌 是 Invitrogen TM ；Cat no.18047-019 ； Lot no.810266. ；Conc 為 50-375U/μl；保存於-20℃。
(B).Oligo dT ：Oligo (dT)12-18primer 0.5μg/μL；廠牌是 Invitrogen
TM ；Lot#767206 ；保存於-20℃。
(C).5 × FS Buffer：5 × First Strand Buffer；廠牌是 Invitrogen TM
；Lot no.709042 ；保存於-20℃。
(D).10mM dNTP Mix：10mM dNTP(2’-deoxynucleoside 5’-triphospate) Mix consists of all four nucleotides(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，
Size：1mL。廠牌是 Gene Direχ®；Cat No. DN0010.；保存於-20
℃。
(E).0.1M DTT：500μL；廠牌是 InvitrogenTM；Lot no.707966.
；保存於-20℃。
(F).RNase inhibitor：Rnase OUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor 5000U (40U/μL) ；廠牌：Invitrogen TM；Lot no .832047.；保存於 -20℃。
(G).RTase (M-MLV RT)：M-MLV Reverse Transcriptase 40000U (200 U/μL) ；廠牌是 Invitrogen TM；Lot no. 825017.；保存於-20℃。
(H).10X DNase Buffer：RQ1 DNase 10X Reaction Buffer 1mL
；廠牌是 Promega；Lot no. M198A 21542609；保存於-20℃。
(I).2.0 × Master Mix Red：Taq DNA pol 2.0 × Master Mix Red (MgCl2 1.5mM)；廠牌是 Ampliqon II；Lot no.5200300-10H17；保 存於-20℃。
(J)10.RT-PCR primer：
(a).MMP-2 primer：
Forward：5’- CAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATA -3’
Reverse：5’- GGTGCAGCTCTCATATTTGTTGC -3’
(b).MMP-7 primer：
Forward：5’- GTATGGGGAACTGCTGACATCATG -3’
Reverse：5’- CTGAATGCCTTTAATATCATCCTG -3’
(c).MMP-9 primer：
Forward：5’- TGGGCAAGGGCGTCGTGGTTC -3’
Reverse：5’- TGGTGCAGGCGGAGTAGGATT -3’
(d).TIMP-1 primer：
Forward：5’-TCAACCAGACCACCTTATAC -3’
Reverse：5’- ATTCCTCACAGCCAACAG -3’
(e).TIMP-2 primer：
Forward：5’-GTAGTGATCAGGGCCAAAG -3’
Reverse：5’- TTCTCTGTGACCCAGTCCAT -3’
(f).β-actin primer：
Forward：5’- TGTTACCAACTGGGACGACA -3’
Reverse：5’- GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA -3’
(K).DEPC-H2O：Diethyl pyrocarbonate D5758 - ≥97% (NMR) ；廠牌 是 Sigma-Aldrich®;CAS Number: 1609-47-8; 保存於：2-8℃
(L).10X TBE Buffer：Ultra PureTM10X TBE Buffer 1000mL；廠牌是 Invitrogen TM；Lot no. 376964.；保存於：-15-30℃
(M).100bp DNA Ladder RTU 50μg/500μl；廠牌 Gene Direχ®
；Cat No.DM001-R500；Lot no. 606027.； 保存於-20℃
(N).β-ME：2-Mercaptoethanol，for electrophoresis，﹥﹦98﹪
廠牌是 SIGMA®；Cat No.M7154-100ML Bach＃025101271。
(P).Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose (DMEM)：High Medium(1L) (2×500ml 過濾)
(Q).Total RNA extraction kit 使用試劑批號 Cat No.YRB50。
2.2 檢體採集：細胞培養(Cell culture)
(1).解凍細胞
先將冷凍小管取出，於 37℃快速回溫，冷凍小管中的細胞液移入 離心管中離心 5 分鐘 1500 rpm，移除上清液。再加入 1ml 培養基，細胞
再次懸浮後於 10 cm dish 中加入 6-8 ml 的培養基，打散細胞均勻後，置入 37℃、5％CO2 細胞培養箱中靜置 24 小時後更換細胞培養基。
(2).細胞繼代培養方法
A549 培養於內含 90% Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose (DMEM)、10% FBS、1﹪P/S，待細胞長 8-9 分滿時，移除舊培 養基，以滅菌 PBS 2 ml 清洗 2~3 次後，加入 1ml 的 Trypsin ，並輕輕
加入 1ml 的 Trypsin-EDTA，並輕輕搖晃 dish 使 Trypsin-EDTA 均勻，
再放到培養箱 3~5 分鐘後 (Typsin-EDTA 作用將細胞切下)，再加入培 養基 1 ml 混合均勻，收集細胞液以 25℃、轉速 1500-2000 rpm 離心五 分鐘。移除上清液再加入適量 Freezing medium (冰浴， DMSO： FBS
＝1：9) 打散細胞均勻後，平均分配於冷凍管內，並置於冰箱保存。
Tomatidine 50mM 將之稀釋成 5mM(即稀釋 10 倍，稀釋液是使用 培養細胞之培養基)，分別將之調配成 10μM、20μM、30μM、40μ M 等濃度於無菌的離心管中。
(2) Tomatidine 處理步驟
將 A549 細胞(5×105 cells)培養於 10 cm dish，隔日待細胞貼盤，細 胞約長至 4~5 分滿。加入不同濃度的 tomatidine (10、20、30、40μM) 及 與 tomatidine 最高濃度相同的 DMSO 當作溶媒作控制組，同時以未加
任何試劑作空白試驗，置於 37℃、5% CO2恆溫培養箱中培養 24 小時。
2.4 細胞存活率實驗（MTT assay） ：
將 A549 （3x103 cell/well）培養於 96 孔培養盤，培養 24 hr 待細胞 貼附後移除培養液，加入不同濃度的 tomatidine （10、20、30、40 μM）
及未加任何試劑作空白試驗（Control），置於 37℃、5％ CO2恆溫培養箱中
(1) 配製雙面含 0.1% matrigel-coated polycarbonate membrane：
將膜攤平於 10 cm dish 內(無菌操作)，而兩面必須無氣泡、完全 浸潤於 0.1% growth factor reduce matrigel solution (BD biosciences)，並 置於 37℃、5% CO2恆溫培養箱中作用至少一小時，隨後取出膜晾乾至 少一小時。
(2) 細胞處置：
將 A549 (5x105 cells/well) 培養於 10 cm dish 內，待細胞長至 7~8 分滿後，加入以血清培養基所配置之不同濃度的 tomatidine (10、
20、30、40 μM)及與 tomatidine 未加任何試劑作空白試驗（Control）， 置於 37℃、5% CO2恆溫培養箱中反應 24 小時。
2.6 RNA 抽取流程(Total RNA extraction)
使 用 RBC Bioscience 廠 牌 total RNA extraction kit ﹝ Mini ﹞ Cat No.YRB50；Lot No.PG-924-10165；保存於室溫 15-25℃。
(1). Cell Harvesting
將藥物處理過後的細胞去除上清液，加入 PBS 2 ml 清洗兩次。
加入 500μl RB buffer(含 β-ME)，並刮取細胞，冰在- 80℃ or -20℃冰箱 結晶 10~20 min(產生冰晶)讓細胞破更完全。(1ml RB buffer 須添加 10 μl β-ME)。
(2). Lysis
放置 filter Column set. 加入樣品到 Column 離心 2 分鐘，轉速 13000 rpm。將離心後的上清液移至新的 1.5 ml 離心管，filter Column set 丟棄。
(3). RNA Binding
先放置 RB Column set，將樣本與 400μl 70% 酒精混合後，上下 旋轉三次(先前 500μl RB buffer＋400μl 70% 酒精＝900μl)，再取 500 μl 加入 RB Column，離心 2 分鐘轉速 13000 rpm，將剩餘的樣本取出 再一過次 Column，離心 2 分鐘轉速 13000 rpm，將 RB Column 取下放 置新的 1.5 ml tube，下管與廢液丟棄。
(4). Recommended Step：DNA residue degradation
20μl DNase I 和 10μl 10X DNase buffer 70μl 和 DEPC-H2O 加入
rpm 將下層液體拋棄，離心 3 分鐘轉速 13000 rpm 將剩餘酒精液體離乾 淨。
(6).RNA Elution
將 RB Columin 放至於新的 1.5 Tube，加入 50μl RNase free water (DEPC-H2O)，離心 3 分鐘轉速 13000 rpm，離心 1 分鐘去 elute purified RNA。
2.7 核醣核酸定量(RNA quantitative)
(1).使用 CB-4500 微量分光光度計。
(2).使用 HITACHI U-1900 Ratio Beam Spectrophotometer 測定。
將吸光值換算成濃度公式：
，DNA inμg/μl。
也可換算 1 OD RNA＝40ng/μl；1 OD DNA＝50ng/μl(當然也要回 乘稀釋倍數)。
2.8 反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse transcriptase polymerase chain reaction ,RT-PCR)
(1).原理
反轉錄酶以 RNA 為模板合成 DNA 即 cDNA，接下來再利用 PCR 的原理大量增殖這段 cDNA。
(2).RNA 反轉錄過程：
(A).取 RNA sample 後，加入 Oligo-dT 0.5μl，以 DEPC-H2O 補體積 至 10.4μl，以 PCR machine 執行以下時間溫度。
(B).依序加入 4μl 5X First-Strand Buffer、2μl 10 mM dNTP Mix、2 μl O.1M DTT、1μl RNase inhibitor(40μM/μl)、0.6μl Reverse transcriptase 混合後以 PCR machine 執行以下時間溫度。
2.9 去氧核醣核酸定量(cDNA quantitative)
參閱 2.7.(1).與.2.7.(2).說明。
2.10 聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)
(1).擴增目標片段：
依序加入 cDNA sample、0.5μl Forward primer、0.5μl Reverse primer、2μl dNTPs、3.5μl 2.0 × Master Mix Red(MgCl2 1.5mM)混 合後以 DEPC-H2O 補體積至 20μl。
(3).DNA 凝膠電泳(Gel electrophoresis) (A)原理
利用凝膠電泳分析 DNA 片段大小，DNA 是一種酸，在中性條 件下帶有負電荷，因此會往正極泳動。
(B)操作步驟
將 10×TBE Buffer 稀釋成 0.5×TBE Buffer，取 50ml 或 80ml 溶液，
用微量天秤粉末的 agarose 0.75g 或 1.20g，將膠配製成 1.5% agarose gel，agarose 在高溫下熔解，插上梳子，在膠體冷凝後，拿掉梳子留 下的槽溝，將 DNA 注入井孔中，使電流通過製備的水平凝膠體，以 100V 運行 45 分鐘後，進行染色。
(4).Ethidium Bromide(EtBr)染色，拍照記錄結果。
(A)原理
利用細胞化學染色可觀察細胞內化學分子的位置，DNA、RNA 為酸性，可用鹼性染料。DNA 和染劑結合在紫外光照射下可發出粉
紅色產物。
(B)操作步驟
將產物 1.5% agarose gel 放入 Ethidium Bromide(EtBr)染色 20 分 鐘，退染 20 分鐘，將產物 1.5% agarose gel 撈起，照膠(Digimage system
&UV Transilluminator)，拍照記錄結果。
2.11 統計分析 (Stastistical analysis)
數據為平均值±標準差 (Mean ± SD) 來表示，以 one-way ANOVA 來 評估統計上的差異，而 p＜0.05 表示具有顯著差異。