3-1 菌種來源與保存
菌種來源
菌種名/菌種編號 提供來源
白色念珠菌(Candida albicans MYA a -2876) 北醫醫科所蘇慶華教授 金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC b 10780) 臺大微生所黃慶燦教授 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans ATCC 25175) 北醫生工所楊正昌教授 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) 臺大微生所黃慶燦教授 大腸桿菌(Escherichia .coli ATCC 25922) 臺大微生所陳進庭教授
a 美國菌種保存中心
b 食品工業發展研究所生物資源保存中心
菌種保存方法
取培養至穩定期(Stationary phase)的懸浮菌液，以 PBS 清洗三次並回溶於含 25％ (v/v)無菌甘油(Glycerol)的PBS中，分裝入1.5 mL微量離心管中，於-70℃下 冷凍保存。實驗操作期間，每個月定期解凍重新活化一次，待凍菌回溶後，以接 種環(Loop)沾取菌液在固態培養基上做四區劃線，至於37℃培養至隔夜，再取一 個單一菌落接種於液態培養基中於37℃隔夜培養，隔日沾取菌液在固態培養基上 做四區劃線，每週自固態培養基重新活化一次，成為每週實驗用之菌種，實驗期 間則以適當之洋菜平板培養基保存於4℃下。
菌種 Stock 的固態保存，除了白色念珠菌培養於酵母萃取粉腖葡萄糖瓊脂 平板培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose broth agar；YPDA，含 1.5% Agar)，其 餘菌種(包括金黃葡萄球菌、轉糖鏈球菌、綠膿桿菌及大腸桿菌)皆培養於胰大豆
3-2 材料
實驗材料來源
實驗類別 藥品名稱 來源 光感物質配製 赤蘚紅 Sigma 兩面黑光石英比色槽 信德 聚偏二氯乙烯過濾膜，孔徑0.22 μm PVDF filter Milipore 懸浮菌體 胰大豆蛋白培養基Tryptic soy broth (TSB) BD 殺菌實驗 酵母萃取粉腖葡萄糖瓊脂培養基
Yeast Extract Peptone Dextrose broth (YPD) BD 洋菜膠Agar, granulated BD 磷酸緩衝溶液phosphate buffer saline, pH 7.4 Biokit 塑膠比色槽 信德 平底微量滴定盤96-well microtiter plate Costar 微量離心管1.5 ml Eppendorff 霈璟 生物膜殺菌 反應塑膠盒(Polymethylpenten；PMP) 永吉 實驗 鐵氟龍轉盤(rotor)
316L不銹鋼錠片(disk)
3-3 儀器
實驗儀器來源
儀器名稱 來源
‧ 紫外光-可見光光譜儀UV-visible spectrophotometer DU-800 Beckman coulter
‧ 迴轉恆溫振盪培養箱Orbital shaking incubator OS/500
‧ 水平式無塵無菌操作台3HT-24 海天
‧ 綠色發光二極體矩陣
Green Light LED (540±5 nm，22 mW/cm2) (圖三) 工業技術研究院
‧ 蒸氣高壓滅菌釜Autoclave 永吉
‧ 轉動式幫浦 Masterflex
‧ 雷射共軛焦顯微鏡Confocal microscope TCS SP5 Leica (Germany)
3-4 實驗方法
3-4.1 懸浮菌體培養
菌種培養條件
菌種名 培養基 白色念珠菌(Candida albicans MYA -2876) YPD 金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC10780) TSB 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans ATCC 25175) TSB 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) TSB 大腸桿菌(Escherichia .coli ATCC 25922) TSB
金黃葡萄球菌、綠膿桿菌及大腸桿菌培養部份，以接種環自 4℃保存的固態 平板培養基中挑取單一菌落，接種至 3 mL TSB /螺旋試管中，於 37℃、轉速 150 rpm 恆溫震盪培養；隔夜取 100 μL 再接種至 100 mL TSB /三角錐形瓶中作為大 量培養，同上述小量培養條件、培養約 16~18 小時，此時菌體生長達初穩定期 (Stationary phase)，為本實驗操作之原始菌液來源。白色念珠菌及轉糖鏈球菌培 養部分，同樣以 Loop 自 4℃保存的固態平板培養基中挑取單一菌落，接種至 30 mL 培養液(YPDB；TSB) /三角錐形瓶中，於 37℃、轉速 150 rpm 恆溫震盪培養 14、16 小時，此時菌體生長達初穩定期(Stationary phase)，為本實驗操作之原始 菌液來源。
取出 1 mL 菌液於 1.5 mL 微量離心管中(依實驗條件取數管)，進行離心 (8,000 rpm, 5 min)，離心後取出上清液，加入 1 mL 新鮮的磷酸緩衝液(PBS)，此 動作重複循環三次。將菌液集中於 15 mL 離心管，混合均勻後依適當比例進行 倍稀釋成 1 mL，進行吸光值測定，O.D.600 所得的值為 0.6 時，相對於菌液濃度 約為 108 CFU / mL (白色念珠菌約為 107 CFU / mL)。
3-4.2 赤蘚紅對懸浮菌體之光動力抑制
使用
PBS 配製光感物質 Erythrosine stock 20 mM (經過濾後)，再以無菌 PBS 稀釋，由於與菌體 1：1 混合後濃度減半，故配製濃度需為最終目標濃度兩倍。將培養好的菌液經洗菌(8,000 rpm，5 min，去除上清液，加入等量 PBS。此動作 重複三次)步驟後，取 100 μL (108 CFU/mL；白色念珠菌為 107 CFU/mL)菌液，
加入等體積之 PBS (控制組)或不同濃度光感物質(條件組)溶液均勻混合，於室溫 及避光的環境下作 10 分鐘。作用後進行去除周圍光感物質(12,000 rpm，1 min，
去除上清液，加入等量 PBS。進行清洗一次)，接著移至發光二極體矩陣 LED 燈 源下進行照光，使用光源波長為 540±10 nm，強度 22 mW/cm2，分別給予不同的 照光能量強度，計算照光時間如下列公式 1。照光完畢後立即取出 100 μL 原液，
利用無菌 PBS 進行 10-1~10-6倍序列稀釋，接著將稀釋菌液取 10 μL 滴於固體培 養基上，於 37℃下培養隔夜後進行菌落計數。定量分析活菌體存活率 (Survival fraction)是以光動力作用後生菌數密度(以適當培養基測定經序列稀釋後的菌落 生成數)除以原始生菌數密度作為計算。計數各平板上之菌落數時選擇介於 3~30 CFU (Colony Forming Unit)，如菌落數低於 3，列為太少不計。
output power (mW/cm2)× irradiation time (sec)
Light dose (J/cm2) = (公式 1) 1000
3-4.3 生物膜培養
生物膜培養反應器為參考 Pitt 等人所設計改良的 rotating disk reactor65；為一 個 500 毫升聚丙烯材質容器(Nelgene, Rochester, NY)及鐵氟龍轉盤(rotor)組成反 應器的主體，轉盤上裝置 24 片可取下的 316L 不銹鋼圓片(disks)66。反應器如圖
置於生物膜反應器中，於室溫下靜置培養 24 小時。24 小時後，去除 150 mL 之 培養液，以 1% 相同之液體培養基進行流動培養，轉動式幫浦(Masterflex ®, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL, USA)之流速為 240 mL/hr (白色 念珠菌轉速為 60 rpm/min，金黃葡萄球菌及轉糖鏈球菌則靜置流洗) 。
3-4.4 赤蘚紅對生物膜之光動力抑制
取培養成生物膜後的不銹鋼圓片置於48-well微量滴盤中，加入300 μL不同濃 度之赤蘚紅溶液，於室溫及避光的環境下作用10分鐘。作用後進行去除周圍光感 物質(移除光感物質，加入等量PBS，進行清洗一次)，接著移至發光二極體矩陣 LED燈源下進行照光，使用光源波長為540±10 nm，強度22 mW/cm2，分別給予 不同的照光能量強度，進行光動力作用後取出disk至含有10 mL PBS的15 mL離心 管中，劇烈震盪約30秒，將不銹鋼圓片上的生物膜菌體震盪下來，接著取1 ml 的樣品於1.5 mL離心管中，經過續列稀釋後取10 μL滴於固體培養基上，於37℃
下培養隔夜後進行菌落計數。實驗中以添加光感物質但未照光與未加光感物質也 未照光之菌液為控制組。
3-4.5 赤蘚紅母液之配製
利用 PBS 配製 stock 濃度為 20 mM 之赤蘚紅，經均勻溶解後，再以0.22 μm 之無菌過濾膜進行過濾，避光儲存於 4℃冰箱；實驗前將母液取出，置於室溫下 回溫後，再以無菌 PBS 進行稀釋至目標濃度。
3-5 統計分析
各實驗結果均經三次獨立實驗測試後，所有結果數據以 mean ± SD 呈現，
分析方法為 T-檢定(Student’s t-test)，檢定實驗所得之組數間是否具有顯著差異。