實驗動物及材料
本研究使用年齡6 到 8 週體重 19-23 克 BALB/c 母鼠及實驗室自行交配繁殖 的基因轉殖鼠(FVB)。依照實驗動物管理與使用指導方針，將所有的老鼠養在特 殊無致病原、恆溫（22-25℃）及飲水飼料充足的飼養環境中。Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) (Sigma) 將 5% (w/v) TNBS 溶於 50%乙醇。使用藥物有 0.5 M 香草醛是溶於100％乙醇，而 130 mM 5-Aminosalicylic acid (5-ASA, mesalamine) (Sigma) 是溶於無菌水。
建立TNBS 誘發發炎性大腸症之模式
前ㄧ天老鼠必須禁食後以ketamine和xylazine (2：1) 混合麻醉後，將溶於50
％乙醇中不同濃度0.1毫升的TNBS溶液，利用胃管從肛門插入大約3公分，再緩 慢注入直腸內，並將老鼠倒立30秒。而對照組的則是注入0.1毫升的50％乙醇後，
ㄧ樣倒立30秒。利用這樣的方式，大於95%的老鼠會成功地建立TNBS誘發發炎 性大腸症。然而，若是溶液很快大約10分鐘被老鼠排出來，則必需刪除掉（Ken et al., 2002）。
形態學的分析
先將老鼠解剖取出直腸放入10％福馬林固定，再用石蠟包埋後切片脫蠟，利用 H&E染色法染色封片。形態學的分析是以巨觀及微觀兩種評分方式。巨觀評分 是以肉眼直接觀察大腸的充血、炎症反應及潰瘍程度來評分，有0至5分的標準如 下：0為沒有任何炎症反應和潰瘍；1為局部充血沒有潰瘍；2為無充血的潰瘍；3 只有單一部位有潰瘍和炎症反應發生；4為兩個部位以上有潰瘍和炎症反應發 生；5為潰瘍範圍大於2公分（Wallace and Keenan, 1990）（表1）。而微觀評分 是以病理切片顯微鏡下觀察腸道組織的白血球浸潤、血管密度及腸壁增厚程度來
評分，有0至4分的標準如下：0為無任何炎症反應訊息發生；1為極少量的白血球 浸潤；2為少量的白血球浸潤；3為高量的白血球浸潤、血管密度高和腸壁增厚；
4為瀰漫型浸潤並且杯狀細胞消失、血管密度高和腸壁增厚（Fuss et al., 1996）（表 2）。
香草醛治療急性發炎性大腸症
前ㄧ天先將老鼠禁食後以ketamine和xylazine (2：1) 混合麻醉後，以每0.1毫 升100％的乙醇中含有12.5 mM、25 mM或是50 mM不同濃度的香草醛，在TNBS 利用胃管從肛門直接直腸攻毒時同位給藥，與先前技術ㄧ樣倒立30秒。待24小時 後，犧牲取出直腸，放入福馬林固定，並送動物科學研究所進行切片，以及進行 之後的分生實驗。
香草醛預防及治療發炎性大腸症
由以上實驗，選擇香草醛適當的濃度及體積，進行香草醛預防及治療發炎性 大腸症的實驗。在預防組的實驗上，是在TNBS誘發發炎性大腸症之前，先將溶 於100％乙醇的50 mM香草醛和5-ASA治療陽性控制組連續餵食3天，然後七天後 犧牲；在治療組的實驗上，是在TNBS誘發發炎性大腸症之後，將溶於100％乙醇 的50 mM香草醛和5-ASA治療陽性控制組連續餵食7天後犧牲。皆取出直腸放入 福馬林固定，送動物科學研究所切片，以及進行之後的分生實驗。
組織萃取
將老鼠犧牲後取出直腸放入離心管秤重，先以ice-cold PBS 清洗一次，盲目 剪碎後，再加入等量的ice-cold lysis buffer (100 mM HEPES, pH 7.9、100 mM KCl、100 mM dithiothreitol、1％ NP-40、50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride、
0.1 M benzamidine、50 μg/ml Leupeptin、100 μg/ml Pepstatin)進行均質，以離心的 方式在4℃下 15000 rpm 離 10 分鐘，收集上清液，為細胞質的萃取蛋白質可進
行western blot 分析。取下層沉澱物秤重，再加入同重量的 low salt buffer（100 mM HEPES-KOH, pH 7.9、250 mM KCl、5 mM Spermidine、20％ glycerol、1 mM dithiothreitol、50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride、0.1 M benzamidine、50 μg/ml Leupeptin 、 100 μg/ml Pepstatin 、 200 nM Okadaic acid 、 20 mM sodium orthovanadate、8 nM cypermethrin），再加入總重量0.72 倍的 high salt buffer（100 mM HEPES-KOH, pH 7.9、250 mM KCl、5 mM Spermidine、20％ glycerol、1 mM dithiothreitol、50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride、0.1 M benzamidine、50 μg/ml Leupeptin 、 100 μg/ml Pepstatin 、 200 nM Okadaic acid 、 20 mM sodium orthovanadate、8 nM cypermethrin、1 M KCl）混合，在 4％shake1 小時。之後以 離心的方式在4℃下 12000 rpm 離 20 分鐘，收集上清液，為細胞核的萃取蛋白 質可進行EMSA 分析。用(Bio-Rad)試驗套組來計算蛋白質濃度，並暫存於-30℃，
待之後分析使用（Yang et al., 1998）。
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Electrophoretic mobility shift assay（EMSA）
將10 μg 上述所收集的核內萃取蛋白質與 1 μg/μl poly dIdC 加入反應緩衝液 (10% glycerol、2% polyvinyl alcohol、20 mmol/L HEPES, pH 7.9、40 mmol/L KC1、
7 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L dithiothreitol)，再加入 5 ng/μl 32P end-labeled NF-κB oligonucleotide 為探針，其總反應體積為 20μl，於 25℃反應 30 分鐘，以 6% native polyacrylamide gel 在 0.25 倍 Tris/borate/ethylenediaminetetraacetic acid (TBE)緩 衝 液 進 行 電 泳 ， 在 4℃以 30 V 跑 3 小時。之後再轉印至硝化纖維素膜 (nitrocellulose membrane, Amersham Pharmacia Biotech)，利用 DIG Luminescent Detection Kit 呈色，並以 X 光片呈現結果（Yang et al., 1998）。
西方轉漬法(Western blot)分析
將 10 μg 組織萃取質內和核內不同的蛋白質以 10％的 SDS-PAGE 分離之 後，將分離開的band 以電泳的方式轉印至硝化纖維素膜 (nitrocellulose membrane, Amersham Pharmacia Biotech) 上。再以 blocking buffer (5%脫脂奶粉，pH 7.6 的
20 mM Tris/HCl，140 mM NaCl 及 0.1% Tween 20) 固定，加入抗 p65、IKKα、IKKβ 及IKKα β 磷酸化單株抗體為一級抗體，於 4℃overnight。之後，再以兔子抗 IgG 單株抗體為二級抗體，於室溫反應一小時。結合的抗體以 peroxidase conjugated secondary antibody (Sigma) 藉 由 化 學 螢 光 (chemiluminescence, ECL system, amersham) 的方式偵測，並以 X 光片呈現結果（Yang et al., 1998）。
Reverse-transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）
將老鼠犧牲後取出直腸放入離心管秤重，先盲目剪碎後，以acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform 方 法 收 集 腸 組 織 的 total RNA 。 利 用 任 意 的 hexonucleotides ，在 reverse-transcription reaction solution 中將 RNA 轉換為 complementary DNA，接下來再跑 PCR。這裡使用的 primer 包括有：β-actin sense, 5’-GGAGAAGATCTGGCACCACACC- 3’; β-actin antisense, 5’-CCTGCTTGC -TGATCCACATCTGCTGG- 3’; IFN- γ sense, 5’-GCTCTGAGACAATGAAC -GCT- 3’; IFN-γantisense, 5’-AAAGAGATAATCTGGCTCTGC-3’; IL-4 sense, 5’- TCGGCATTTTGAACGAGGTC-3’; IL-4 antisense, 5’-GAAAAGCCCGAA -AGAGTCTC-3’; IL-6 sense, 5’-TATGAAGTTCCTCTCTGCAA-3’; IL-6 antisense, 5’-CTTTGTATCTCTGGAAGTTTCAG-3’; IL-1 β sense, 5’-CATCCTCTGTGA -CTCATGGG-3’; IL-1βantisense, 5’-CTTCTTCTTGGGTATTGCTTG-3’; TNF-α sense, 5’-TAGCCCACGTCGTAGCAAAC-3’; TNF-αantisense, 5’-CACCCATTC -CCTTCACAGAG-3’。反應的條件包括有：Cycle Ι 為 94℃需 12 分鐘共 1 個 cycle ；Cycle Π 為 94℃需 45 秒，55℃需 45 秒，72℃需 2 分鐘共 36 個 cycle； Cycle 3 為 72℃需 7 分鐘，接下來保持 4℃（Yoshida et al., 1995）。
基因轉殖鼠的構築及確認
我們藉由基因轉殖鼠的構築，了解 NF-κB 在體內表現量的分布，並建立發
炎反應的動物模式。我們請進階生物技術股份有限公司，先利用pNF-κB/repoter 模式，將 pNF-κB/Luciferase（Stratagene）利用胚原核顯微技術注射的方式，送
到老鼠胚胎細胞中，再將胚胎植入母鼠體內。待小鼠出生後，於3 週剪尾，收集
DNA，利用聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR) 檢測轉殖基因的機 率 。 PCR 確 認 所 用 的 引 子 為 primer 1 （ 5’-AACTGCATAAGG -CTATGAAGAGATACGCCC-3’）及 primer 2（5’-TTAAAACCGGGAGGTAGA -TGAGATGTGACG-3’）。進一步再利用南方雜合法分析轉殖基因在小鼠染色體 中的數量。
NF-kB 基因轉殖鼠的繁殖及 Polymerase chain reaction（PCR）確認 我們將構築好的 NF-κB 基因轉殖鼠，分別與同品系野生株小鼠，以ㄧ公多 母或是ㄧ公ㄧ母的交配方式，進行子代繁殖。待小鼠出生三週後剪尾，收集DNA，
再利用上述的兩種primer 藉由 PCR 進行確認，並且計算每次交配組別轉殖基因 的陽性率。如此，可以篩選有效的交配組別，提高子代的繁殖及轉殖基因的機率。
NF-κB 基因轉殖鼠活體影像系統之分析
將 NF-κB 基因轉殖鼠利用上述香草醛治療 TNBS 誘發發炎性大腸症之相同 實驗模式，進行基因轉殖鼠發炎性大腸症實驗。在進行影像分析之前必須先將老 鼠麻醉，並且把腹部的毛刮除。然後將取同重量體積的溶於PBS 中的 D-Luciferin (150 mg/kg, Xenogen)，以腹腔注射方式注入老鼠體內，之後待 15 分鐘後，直接 把老鼠放進密封不透光裝有25mm 鏡頭的 CCD 相機和影像增強器相連構成的極 敏感相機儀器 (核能研究所同位素應用組提供)（IVIS Imaging System, Xenogen Corporation） 中，進行全身性活體影像分析。接下來迅速解剖取出直腸放在培 養皿上，直接放進儀器中進行分析，再計數ROI 值 (相對光點數值)，而 ROI 是 將老鼠放射出來的luminescence 利用程式進行定量，單位是 photon/sec/cm2並作
成圖表。之後取出來的直腸，先用phosphate buffered saline (PBS) (137 mM NaCl，
2.7 mM KCl，4.3 mM Na2HPO4及1.4 mM KH2PO4)小心沖洗避免血液干擾，再放 入2 毫升的離心管秤重。接下來將器官剪碎加入等比例的 triton lysis buffer (50 mM Tris-HCl，pH7.8；1％TritonX-100；1 mM DTT；1 mM PMSF)均質，再將均 質液冷凍解凍兩次之後4℃離心 12000rmp 15 分鐘，收集上清液測冷光及蛋白質 濃度並且分裝至1.5 毫升離心管保存-70℃冰箱。