本研究分為兩部分，實驗一的目的在於探討紅花對缺血- 再灌流 損傷大鼠腦梗塞之效用。首先探討其藥物作用劑量，其次探討在不同 給藥時間下，最有效劑量組在術前給藥、梗塞後 30 分鐘後給藥、再 灌流後 30 分鐘給藥之效用差別，以探討其治療時機。另外，我們採 用文獻記載 NMDA 拮抗劑-MK801 為陽性控制組，一來驗證本實驗 模型是否穩定、二來可以使紅花與之比較作用效果；實驗二的研究目 的則是對紅花在缺血- 再灌流損傷大鼠腦梗塞作用機轉之探討。
3-1. 動物：
本研究所採用之實驗動物品系為 Sprague-Dawley (SD) 雄性 大鼠，體重介於 300-400 g 之間，實驗分為兩部份：實驗一分為 9 組，每組 6 隻，共計 54 隻；實驗二分為 3 組，每組 6 隻，共計 18 隻。所有的動物來源皆購自國家實驗動物中心，飼養於中國醫藥 大學動物中心，飼養環境採室內中央空調、明暗控制各 12 小時，
水和飼料每日充足供應。實驗室室溫控制在 25±1℃，所有的實驗 過程皆合乎動物倫理原則。
3-2. 動物模型之建立：
本實驗之麻醉劑使用氯化水醛（chloral hydrate, 400 mg/Kg），
採腹腔注射方式給藥麻醉。在實驗過程當中持續監測大鼠之生理指 標- 平均動脈壓、心跳（0093-101L, BP-2, Columbus, Ohio, USA）、
直腸溫度(TM-906A, Dual Channel Thermometer, Taiwan)、中大腦動 脈 腦 血 流 (Laser Doppler Blood-Flow Monitor, DRT4, Moor instrument Ltd, England)。
實驗採用中大腦動脈缺血性梗塞模型：管腔外阻斷方式(25)再加 上兩側總頸動脈阻斷，簡稱 RMCAO+BCCAO （right middle cerebral artery occlusion and bilateral common carotid artery occlusion）。過程 敘述如下： 總頸動脈旁的迷走神經（vagus nerve）分離，用兩只尼龍繩套（nylon thread，直徑約 0.5 mm）分別繞過兩側總頸動脈，再放上套管（直 經約 1.5 mm）。
其次，進行股動脈插管監測心跳、平均動脈壓，其步驟簡述如 下：以手術刀從 SD 大鼠右側鼠蹊部切開成一個約長 2.5 cm 的傷口
，分離出右股動脈，然後插入 PE-50 管（cannulated with PE-50 polyethylene catheters），並用少量 heparin（25 unit/ml）溶液沖洗 PE-50 管，以防止凝固。PE-50 管的另一端，則連接於心跳血壓測 量儀（0093-101L，BP-2，Columbus，Ohio，USA）。整個實驗過程 中，連續監測平均動脈壓及心跳的變化，並記錄之。
插入 PE-50 管後，將大鼠呈俯臥位，並將頭部固定於小動物立 體固定儀（stereotaxic apparatus）上，從頭部左右眼角（canthux）
的正中線及左右耳翼間的正中線切開，使暴露出頭骨。將右側顳肌
（ temporal muscle ） 沿 顳 骨 緣 切 開 ， 用 骨 剪 進 行 顳 骨 切 開 術 (carniectomy)，剪成一個直徑約 5-10 mm 的骨窗。手術過程當中，
若發現腦膜破裂產生大量出血，則動物被排除實驗。以雷射血流監
視器（Laser Doppler Blood-Flow Monitor，DRT4，Moor instrument Ltd,
，England）的探針來尋找並確定中大腦動脈，當監測刻度大於 800 LD units 時，則確定為中大腦動脈。用 8-0-0 尼龍單線微型手術針
（8-0-0 mono-filament nylon tie，ETHICON，Johnson & Johnson Ltd.
，Belgium）於嗅束上緣（Olfactory tract）與下大腦靜脈（Inferior cerebral vein）之間穿過中大腦動脈。麻醉 30 分鐘後，將兩側總頸 動脈上的套管套緊，並將 8-0-0 尼龍線以單套活結綁緊至活結下游 中大腦動脈供血區腦膜變白，而雷射血流監視器的刻度出現 50 LD units 以下時，則可確定血流阻斷成功。
3-3 藥物製備、給藥劑量及方式 3-3-1 藥物來源及製備：
紅花之來源及製備：
紅花的製劑委託科達製藥股份有限公司製作。首先秤取 80 克 紅花原生藥（原產地中國大陸四川省），將藥材置入不鏽鋼鍋，加 入 7 倍水，加熱沸騰煎煮 50 分鐘，以 100 目篩網過濾。將藥渣加 入 5 倍水，加熱沸騰煎煮 50 分鐘後以 100 目篩網過濾，收集二次 濾液進行濃縮，最後產物為 27.48 克（34.35 %）。取濕浸膏 25 g，
加入 131.7 ml phosphate buffer saline（PBS，PH7.4）成為濃度 0.2 g/ml 之紅花溶液。
MK801 購自 SIGMA 藥廠（SIGMA-ALDRICH CHEMIE Gmbh P.O. 1120，89552 Steinheim, Germany 49-7329-970），用 phosphate buffer saline（PBS, PH 7.4）配置為濃度 1 mg/Kg，分裝保存於 4 ℃ 的冰箱中。
3-3-2 給藥劑量：
紅花給藥劑量之決定：
紅花劑量的決定是根據預試驗（pilot study）的結果得知紅花 0.2 g/Kg 腹腔注射能夠減小缺血— 再灌流損傷大鼠腦梗塞面積，因 此本實驗採 0.2 g/Kg、0.4 g/Kg、0.6 g/Kg，分別於腦血流阻斷前 10 分鐘施行腹腔注射。另外，採用紅花 0.4 g/Kg 分別於血流阻斷 後 30 分鐘，及再灌流後 30 分鐘施行腹腔注射。
3-4. 動物分組及流程 3-4-1 實驗一
3-4-1-1 動物分組
將 54 隻 SD 大鼠以隨機分為 9 組，每組 6 隻(圖 3.1)：
(1) 控制組(C)：阻斷兩側總頸動脈和右中大腦動脈的血流 90 分鐘，然 後再灌流 24 小時，不施予任何藥物治療。
(2) 空白對照組(PBS)：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射 0.2 ml/Kg PBS。
(3) 陽性對照組(MK)：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射 MK801 1mg/Kg。
(4) 假手術組(S)：只用 8-0-0 尼龍線穿過中大腦動脈，但 不阻斷腦血流 (5) P-0.2 組：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射紅花 0.2
g/Kg。
(6) P-0.4 組：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射紅花 0.4 g/Kg。
(7) P-0.6 組：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射紅花 0.6 g/Kg。
(8) O-0.4 組：方法同 C，於腦血流阻斷後 30 分鐘腹腔注射紅花 0.4 g/Kg chloral hydrate 於大鼠腹腔注射，將大鼠麻醉。將大鼠固定於立體定 位儀上，剔除頭上毛髮後，用骨剪在大鼠頭顱打一個洞，找出中大腦
3-4-2 實驗二
將 18 隻 SD 大鼠隨機分為 3 組，每組 6 隻（圖 3.2）：
(1) 控制組(C)：阻斷兩側總頸動脈和右中大腦動脈的血流 90 分鐘，
然後再灌流 24 小時，不施予任何藥物治療。
(2) 對照組(MK)：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射 MK801 1mg/Kg。
(3) 治療組：方法同 C，但於腦血流阻斷前 10 分鐘腹腔注射紅花 0.4
3-5. 生理、生化指標之測定
整個實驗過程中，大鼠的生理指標都被監測。同時生化值也被測 定。
3-5-1 體重的測量：
於實驗厭前及再灌流 24 小時動物被犧牲前，大鼠的體重分別 被測量。
3-5-2 肛溫的測定：
於實驗前，再灌流 2 小時及 24 小時犧牲前大鼠的肛溫分別被 測定。另外，腦血流阻斷後再灌流前，大鼠的肛溫每 15 分鐘 測定一次。
3-5-3 心跳、動脈壓的監測：
整個實驗過程，大鼠的平均動脈壓及心跳，每 15 分鐘測定一 次。
3-5-4 周邊血液的測定：
再灌流 24 小時後，動物犧牲前，用注射空針從股靜脈抽血 3.0 cc，測定周邊血液的血球及生化。
將裝有 0.5 ml 靜脈血之 EDTA 管均勻搖晃後，置於血球分析儀（
System KX-21, SYSTEM Ltd., KOBE, Japan）之探頭下，測定血液中
白 血 球 （ WBC）、 紅 血 球 （ RBC ）、 血 紅 素 （ HGB）、 血 球 比 容
（HCT）、平均血球體積（MCV）、平均血球血紅素（MCH）、平均血 球血紅素濃度（MCHC）、血小板（PLT）、淋巴球（Lym）、及淋巴球 百分比（Lym %）。所用試劑包括：cell pack（SAN TUNG Instruments Co. Ltd., Taiwan）、SWH-200（SYSMEX Co. Ltd, KOBE, Japan）及 cell clean（SYSMEX Co. Ltd., KOBE, Japan）。
將 裝 有 2.5 ml 靜脈血之離心管靜置半小時後，置於離心機
（KUBOTA 6900, KUBOTA Co., Japan）中，用 3400 rmp 離心 10 分鐘 後，用 dropper 吸取上清液至小試管中，再放至-80 ℃冰箱中冰存，
待 54 隻 SD 大鼠血清收集齊全後，將之解凍，置於生化分析儀上
（Roche, COBUS, MIRA）中，測定 GOT、GPT、BUN、Creaatinine
、血糖的濃度。所用試劑包括 GOT、GPT、BUN、Sugar（以上試劑 來源— RAICHEM, San Diego, CA, US）及 Creatinine（Bayer Co., NY, USA）。
3-6. 神經學狀態評估
再灌流 24 小時後犧牲前，進行神經學狀態評估(46)。神經狀 態的評估是由不知道實驗分組的助理人員執行，神經狀態等級如 下（圖 3.3）：
0 級 1 級
2 級 3 級
圖 3.3、神經狀態的等級劃分。0 級：用手從鼠尾將大鼠拉上，使 老鼠懸空，老鼠兩側前肢伸展，則為 0 級（左上）；1 級：用手從鼠 尾將大鼠拉上，使老鼠懸空，與手術施行之對側前肢彎曲，則為 1 級（右上）。2 級：輕拉鼠尾，使老鼠懸空兩前肢抓住鐵籠，若從對 側肩部施壓，麻痺測的阻力降低，則為 2 級（左下）。3 級：除了第 二級的現象外，大鼠自由行進時，向麻痺繞圈，則為 3 級（右下）
。
3-7. 腦梗塞面積之測量
再灌流 24 小時，經神經學評估後，用 chloral hydrate（400mg/Kg
）腹腔注射將大鼠麻醉。以手術刀從大鼠的左蹊部皮膚切開，分 離出左股靜脈，然後用空針從靜脈取血 3 cc，其中 0.5 cc 放入 EDTA 管中，進行周邊血液的測量。另外，2.5 cc 裝入離心管，
離心後取其上清液以進行周邊血液生化值的測量。
最後從大鼠的胸廓剪開，暴露出心臟，將右心房用手術刀劃 一小洞，並於左心室以生理食鹽水（0.9 % NaCl，南光化學製藥 股份有限公司，台灣）快速灌流 3-5 分鐘後，將鼠腦取出置於腦 切片盒中（brain matrix slicer）冠切（coronal sections）為厚度 2 mm 的切片，從前額葉算起取前六片（圖 3.4），將之置於含有 2 % 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC, MERCK, Germany）染色 劑的 12-well 培養盤中（CELLSTAR, greiner bio-one），並將培養 盤放入 37 ℃恆溫箱中。20 分鐘後，將培養盤取出，此時可見梗 塞處呈白色、非梗塞部位則是成紫紅色，將 TTC 染色劑回收後，
加入 10 %（MERCK, Germany）固定，將鼠腦各切片取出、擦乾 後以數位相機（Nikon Coolpix 3100, Japan）定距離照相（圖 3.4
），然後置入電腦圖像處理系統（Image-Pro plus, USA）中計算梗 塞面積。
圖 3.4 腦 梗 塞 面 積 的 測 量 。 首 先 取 腦 ， 做 成 切 片 ， 用 2%
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色後梗塞區域成白色，而 非梗塞區則為紫紅色。將經 TTC 染色後的腦組織照相，置入電腦圖 像處理系統中計算梗塞面積。
3-8. 超氧陰離子（superoxide anion; O2-）的測定
超氧陰離子是使用微量化學發光分析儀（Chemiluminescene analyzer system, CLD-110, SCINICS Co. Ltd., Japan）來測定，這套 儀器包括 water circulation （Model CH-201）、photon detector（
Model CLD-110）、chemiluminescence counter （Model CLC-10）
以及一台 32-bit IBM 個人電腦等四部分。測定方法是根據較早期
的研究報告(27,83,84)，簡言之，將 0.2 cc 之全血與 0.1 cc 緩衝液
（PBS, PH7.4）混合後，放入偵測槽中、置入 photon detector
取腦 切片
染色後，
照相存檔
（ Model CLD-110） 的密閉腔 室中，啟動 chemiluminescence counter （ Model CLC-10）開始計數 chemiluminescence（ CL）
counts。200 秒後將 1.0 cc 濃度為 0.01 mM 的 Lucigenin 溶液注射 入儀器-photon detector 的不鏽鋼偵測槽中，CL counts 持續測量至 600 秒後，再將 0.2 cc 的 Zymosan-A 注射入不鏽鋼偵測槽中，爾 後持續計數至 1020 秒為止。CL 值除去血液中 WBC 數目，最後 以 CL counts/ 1000 WBC 的發光值表示。測量步驟如圖 3.5 所示如 下：
圖 3.5 使 用 微 量 化 學 發 光 儀 測 量 超 氧 陰 離 子 的 步 驟 圖 。
3-9. 免疫組織化學染色 3-9-1 腦組織切片的製作：
再灌流 24 小時後，用 Chloral hydrate （400 mg/Kg）腹腔注 射，將大鼠麻醉後，用生理食鹽水進行心臟灌流後，再以 4 % paraformaldehyde （MERCK, Germany） 200 cc 經心臟灌流，將 腦組織固定約 10 分鐘，待大鼠兩前肢僵硬時取腦。將取出之鼠 腦置入裝滿 4 % paraformaldehyde 之大試管內，靜置於 4 ℃冰箱
中 3 天。將 4 % paraformaldehyde 倒除，換成 30 % Sucrose
（GERBU, Biotechnik GmbH D-69251，Gaiberg）溶液，放置於 4
（GERBU, Biotechnik GmbH D-69251，Gaiberg）溶液，放置於 4