第一節 、實驗材料 一、 儀器、器材
1、 無菌操作箱（laminar flow）
2、 二氧化碳細胞培養箱（CO2 incubator）
3、 細胞培養皿 (T25 及 T75 規格)（購自 FALCON）
4、 細胞計數器（Haemocytometer）(購自 Boeco) 5、 96 孔細胞培養盤（購自 FALCON）
6、 離心機（centrifuge）
7、 位相差顯微鏡（phase-contrast microscope）
8、 酵素免疫分析儀 （ELISA reader）（購自 Anthos Labtec，
Australia）
9、 分 光 光 度 計 ： Metertech ， UV / VIS-SP8001 spectrophotometer
10、 分光光度計偵測管
11、 Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell （ 購 自 美 國 Bio-Rad 公司）
12、 Hybond-PVDF transfer membrance （Millipore ; lmmobilon-P transfer membrane）
13、 電泳裝置系統（購自美國 Bio-Rad 公司）
14、 電泳? 膠器（購自美國 Bio-Rad 公司）
15、 Pipetmen 16、 均質器
17、 微量離心管（購自季勗）
18、 冷凍管
19、 3M filter paper 20、 X-ray film (FUJI) 21、 微量天平
二、 藥品試劑
1、 RPMI medium 1640 【內含 10% fetal calf serum（FCS）、
2 mM L-glutamine、100 units/ml Penicillin G、 100
µ
g/ml streptomycin sulfate】（購自 GIBCO）2、 Trypan blue (購自 SIGMA)
3、 Dimethyl Sulfoxide（DMSO）（購自 SIGMA）
4、 5-Fluorouracil （購自 SIGMA；編碼：F6627）
5、 Leucovorin（購自 Wyeth）
6、 Trypsin – EDTA
7、 Phosphate buffer saline (PBS)【由 NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4組成】
8、 Quick Cell Proliferation Assay Kit : WST-1 (購 自 Biovision)
9、 Bio-RAD Protein assay dye reagent concentrat, 450 ml 10、 Protein Standard : bovine serum albumin （1
µ
g/ul）11、 Enhance chemiuminescent (ECL)( 購自美國 Amershan- Pharmacia )
12、 Ammonium persulfate（APS）（購自 SIGMA）
13、 Tetramethyl ethylenediamine (TEMED)（購自 SIGMA）
14、 Phenylmethylsulfonylfluoride （PMSF）（購自 SIGMA）
15、 一級抗體 ：rTSβ type （由本研究室 周寬基博士自行研 發而成）及 TS106
16、 二級抗體：antimouse IgGb
17、 30% H2O2
18、 脫脂奶粉（blotto milk）（購自安佳品牌）
19、 goat serum
20、 AEC 試劑（購自 MERCK）
21、 Haematoxylin 試劑 三、 人類乳癌細胞株的來源：
人類乳癌細胞株 5 株 (細胞株編號：MCF-1、MCF-7、60055、
BT-20、T47D)分別從 ATCC(American Type Culture Collection) 購買。其皆屬於乳腺癌細胞株(mammary gland carcinoma cell lines)。
第二節、方法 ：
一、細胞毒性分析 （Cytotoxic assay）
(一) 人類乳癌細胞株的培養：
首先將存放人類乳癌細胞株(編號：MCF-1、MCF-7、60055、
BT-20、T47D)的冷凍管從液態氮中取出後，插上浮板，迅速放入 37℃水浴中使其快速解凍。取出冷凍管以擦手紙擦拭水滴後，以 70%酒精噴灑冷凍管外部後，移入無菌操作台。之後、將已解凍 的細胞株從冷凍管取出細胞加在含 5 ml 10%胎牛血清之培養基，
離心、 800 rpm、5 分鐘後，將上清液去除（儘量吸乾），再以 tip 來回抽吸方式打散細胞並加入 10 ml RPMI 的培養液於 T25 培養皿中，再將 5 株細胞株置於含 5% CO2的 37℃恆溫培養箱內 培養。每二天更換一次新鮮的培養液，每株細胞均間隔三至四天 就必須分盤培養。細胞分盤、首先將培養皿中舊的細胞培養液吸 出，加入 10 ml 1xPBS 的緩衝液清洗二至三次後，再加入 1 ml 的 trypsin-EDTA 溶液（0.005% trypsin, 0.002% EDTA）於培養 皿中，再放入恆溫培養箱 3 分鐘後，觀察細胞是否以脫離培養皿
（倘若未完全脫離，可用手輕輕拍打培養皿邊緣，以幫助細胞脫 落。），待細胞脫落後，加入 1 ml 的培養液稀釋中和 trypsin-EDTA 的作用，並將細胞吸出至含 5 ml 培養液的試管中，離心、 1500 rpm、5 分鐘後，將上清液去除再加入 2 ml 的培養液，利用 pipet 以抽吸的方式儘量將細胞打散。再將細胞懸浮液均分到新的培養 皿中，進行分盤或經過細胞計數後種入適當數目的細胞至 96 孔 細胞培養盤中預備進行細胞實驗。最後在於培養皿或培養盤中加 入 10%胎牛血清之培養液，即可放入恆溫培養箱培養。
一般在進行細胞實驗時，所使用的細胞株需將細胞解凍後，以繼 代培養三代以上方可進行實驗，因為細胞的生長及特性表現會趨 於? 定。
1.細胞數目計數法：
計算細胞數目是用血球計數盤(如右圖所示)，
以 70% 酒精清洗擦乾，蓋上蓋玻片再取細胞 樣品 20
µ
l 滴入下方三角形之區域，讓樣品依 虹吸現象吸入血球計數盤中。一般血球計數盤有 2 個 chambers，每個 chamber 中細刻 9 個 1 mm2 大正方形，其中 4 個角落之正方形再細刻 16 個小格，深度均 為 0.1 mm。當 chamber 上方蓋上蓋玻片後，每 個大正方形之體積為 1 mm2 ×0.1 mm＝1.0×10-4 ml。
使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，壓線 的細胞一律計數，之後、乘以稀釋倍數，再乘以 104，即為每 ml 中的細胞數目。(如右圖所示)
一般在計數細胞時，應只計數樣品中的活細胞，依照 dye
exclusion 的存活測試原理，利用藍色之 trypan blue 染料會 滲入死細胞中而呈色的特性，而活細胞因細胞膜完整，染料無 法滲入，故無法呈色，因此只計數白色的細胞數。
步驟：取 50μl 細胞懸浮液與 50μl trypan blue 等體積混合均 勻於 1.5ml 微量離心管中。取少許混合液（約 20μl）自血球計 數盤的 chamber 上方凹槽處加入，蓋上蓋玻片後，再放入倒立顯 微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色。然後計數五個大 方格的細胞總數，再除以 5，乘以稀釋倍數，最後乘以 104 ，即 為每 ml 中細胞懸浮液的細胞數。若所含細胞密度過高（每一大 格超過 250 顆細胞），所算出的細胞數目，誤差可能較大，必須 先稀釋細胞後，再重新計數。稀釋時必須詳細計算稀釋倍數。若 樣品先經過稀釋才計數，則原樣品中的細胞數應再乘回稀釋倍數
（例如：染 trypan blue 時，樣品與 trypan blue 等體積混合，
故稀釋倍數至少乘以 2）。
2.細胞毒性分析法：
本實驗採用較新的 tetrazolium salt 的 kit，此 kit 是由 WST-1 試劑（lyophilized）與 ECS（Electro Coupling Solution）
25 ml 混合而成。其測定原理是根據 MTT 的測定方法，基本上是
利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步 測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則 活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。
利用此一原理，也可以來測定細胞的增 生 (cell prolifer- ation) 、 存 活 率 (percent of viable cells) 及 細 胞 毒 性 (Cytotoxicity)。但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度 較高，對懸浮性細胞則較不理想。針對 WST-1/ECS 試劑的優點 為：不需要沖洗，直接加入即可作用，也不需要經過溶解的步驟，
相較於 MTT 的測定方法，此 kit 所實驗出來的結果較快速且敏感 性佳。
步驟：將以計數過的細胞，分別各取 5000 顆至 20000 顆，放入 內含 100μl 之細胞培養液的 96 孔細胞培養盤中，再放進含 5%
CO2、37℃的細胞培養箱內，放置 24 小時後，取出加入抗癌藥物 5-FU，其濃度分別為 1.6 μM 至 50 mM。另一組加入 5-FU 同時 又加入 leucovorin (LV) 1.25 mM，混合均勻後，再放入細胞培 養箱，經過 72 小時後，取出 96 孔細胞培養盤，各別加入 WST-1/ECS 試劑 10μl 在每一個 well 中，混合均勻後，分別放 置 1 小時、2 小時及 4 小時，之後取出振搖一分鐘，再利用酵素 免疫分析儀（ELISA reader）去測定第 1 小時、第 2 小時及第 4
小時的 OD 值（波長設定為 450 nm、630 nm）。每一種細胞株都 做三重覆，以求實驗結果更加精確。
＊乳癌細胞株的生長曲線製作：
利用血球計數盤取出五種不同的細胞株，以 40000 顆的細胞為 主，用 1 比 2 的稀釋比例配製成以下細胞數，分別為 20000 顆、
10000 顆、5000 顆、2500 顆、1250 顆、625 顆及 313 顆，並種入 96 孔細胞培養盤中，再放入細胞培養箱，經 24 至 72 小時後，利 用倒立顯微鏡來觀察五種不同細胞株的生長情形並繪製生長曲 線。
二，西方墨點法（Western blotting）
利用此法來檢測人類乳癌細胞內與抗藥性相關蛋白質的表現
（一）、細胞蛋白質萃取：
先將已長滿細胞的 T75 細胞培養盤從培養箱取出後，吸出培養 廢棄液，再以 10 ml 的 1 x PBS 緩衝液小心清洗 3 次後，加入少 量的 1 x PBS 緩衝液於 T75 細胞培養盤中，用刮杓將培養盤中的 細胞全部刮出，之後倒入離心管中離心，2000 rpm、10 分鐘後，
倒掉上清液，加入 150 μl 的 lysis buffer (1% Nonidet P-40
＋10% SDS＋0.5% sodium deoxycholate ) 及 10 mg/ml PMSF 適
為蛋白質標準品。利用 Bio-Rad Protein Assay Kit (美國 Bio-Rad 公司)套裝式劑，來進行蛋白質定量的檢測。
Bio-RAD Proteinn assay dye reagent
0.8 16 4 200 μl 800 μl 1.0 20 0 200 μl 800 μl
【總體積為 1020 μl， 每個濃度配製二套 】
將配製好的蛋白質標準品的樣品放入石英管中，利用分光光度計波 長 595 λ來測其吸光值。二套之間的吸光值其偏差不能超過 10% ， 否則需重新配製。經過平均後的吸光值與濃度畫出標準品檢量線，
並求出趨勢線方程式及 R2 值。
2.樣品蛋白質定量：
∼依照下列方式製作蛋白質樣品：
稀釋倍數(X) 樣品蛋白質（μl） ddH2O （μl） Protein assay reagent（μl）
5 X 4 16 1000 10 X 2 18 1000 20 X 1 19 1000
【總體積為 1020 μl， 每個濃度配製二套 】
本實驗的蛋白質樣品製作，是將樣品稀釋成 5 倍，再將配製好的蛋
白質樣品放入石英管中，利用分光光度計波長 595 λ來測其吸光 值。二套之間的吸光值其偏差不能超過 10% ，否則需重新配製。將 樣品吸光值的平均值代入趨勢線方程式，則可算出稀釋後樣品之蛋 白質濃度，最後再乘上稀釋倍數，則可求得實際蛋白質樣品濃度。
（三）、膠體電泳分析法（SDS-PAGE）
測定 rTS 及 TS 蛋白質
先配製 0.75 mm 厚度之 10% 下層膠及 4%的下層膠，其配製法如下。
＊ 10 % 下層膠 (10% Separating)：兩片量
先加入 5 ml 的 ddH2O 在 50 ml 的離心管中、再加入 4 ml 的 30%
acryamide/Bis（37.5:1），之後再依序加入 3 ml 的 1.5 M Tris-HCl
（pH8.8）、各 120 μl 的 10﹪SDS 及 10﹪APS，最後再加入 6 μl 的 TEMED (目的是促進下層膠凝集)，等混合均勻後，即為 10 % 下 層膠。
＊ 4 % 上層膠（4% stacking）：
先加入 1.8 ml 的 ddH2O 在 15 ml 的離心管中，再加入 0.36 ml 的 30% acryamide/Bis（37.5:1），之後再依序加入 o.75 ml 的 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、各 30 μl 的 10﹪SDS 及 10﹪APS，最後再加 入 2 μl 的 TEMED (目的是促進下層膠凝集)，等混合均勻後，即為
4 % 上層膠。
＊ 6X Sample buffer 配製法如下：
先加入 1.5 ml 的 2M Tris-HCl（pH 6.8）在 15 ml 的離心管中，
再依序加入 0.93 gm 的 DTT、1.2 gm 的 SDS 及 Bromophenol blue 、再加入 6 ml 的 100% Glycerol，最後再加 ddH2O 至總體 積為 10 ml，並分裝在 1.5 ml 的微量離心管中，於 -20℃下保存。
＊ 10 X Running buffer（10 X Tris-glycine）配製法如下：
取 30 g 的 Tris-base 、再取 144 g 的 glycine 後，加入 100ml 的 10﹪SDS，最後再加 ddH2O 至總體積為 1000 ml，4℃ 保存，使 用前先稀釋成 1X。
步驟：將配製好的 10% 下層膠注入? 膠台後，緩緩加入 ddH2O 以 去除氣泡，並壓平下層膠之上緣，放置 30 分鐘等膠體凝固後，再 將 4 % 下層膠緩緩注入，並插入樣品槽梳子（comb）至未凝固的 膠體中，避免氣泡出現於樣品槽（wells）下緣。放置約 20 分鐘 等膠體凝固後、再拔出樣品槽梳子並以 ddH2O 小心沖洗樣品槽內，
避免雜質殘留。將? 好的樣品槽放入電泳槽中，加入 1X Running buffer 至高過樣品槽，用針筒以抽吸的方式去除膠體下緣殘留的 氣泡。之後、再準備 loading 預測定的蛋白質樣品。
首先、先 loading 5 μl 的分子量標準品（rainbow marker），再
依序由左至右 loading 已配製好的樣品（此樣品與 6X Sample buffer 依照比例混合後，經 95℃加熱 5 分鐘後，於-20℃下冷卻 5 分鐘）至樣品槽中，以設定 75 伏特、跑膠 2 小時。
（四）、西方墨點法（Western blotting）：
Semi-dry 轉漬法：
＊ Transfer buffer 配製法如下：
取 8.72 g 的 Tris-Hcl 、再取 4.4 g 的 glycine 後，加入 1.5 L 的 ddH2O，混合均勻後，將所配製的溶液調整其 PH 值至 8.4，再
取 8.72 g 的 Tris-Hcl 、再取 4.4 g 的 glycine 後，加入 1.5 L 的 ddH2O，混合均勻後，將所配製的溶液調整其 PH 值至 8.4，再