第二章 材料與方法
採檢對象本實驗之研究對象為配戴隱形眼鏡者。配戴長戴型隱形眼鏡者，收集其 拋棄液、生理食鹽水、隱形眼鏡保存盒擦拭物及盥洗台擦拭物。配戴拋棄 式隱形眼鏡者，則收集其已使用過之拋棄式隱形眼鏡及盥洗台擦拭物。此 外，台大醫院 2006 年 9 月~2008 年 6 月，送檢之疑似感染棘阿米巴患者之 角膜刮取物，亦一併培養檢查。
一、 採檢方法
依受試者所配戴隱形眼鏡的種類，給予適合的採檢管及採檢說明書 (附 錄一，附錄二) 。
二、 檢體之培養
將回收到的檢體編號，隱形眼鏡保存盒擦拭物及盥洗台擦拭物分別加 入 3 ml 無菌去離子水混合均勻後，連同拋棄液及生理食鹽水等檢體離心 後取沉澱物。再將沉澱物接種到塗有大腸桿菌的 Page's ameba saline agar plate (Martinez , 1985) (附錄三)中央，並標明編號。再將此培養皿置於 30°C 的恆溫箱中培養，從第二天開始，連續觀察七天阿米巴的生長情形 (李, 1994)。以光學顯微鏡 100 倍作整個培養皿初步的觀察。疑似有棘阿米巴 生長，則於載玻片上滴一滴 Page's ameba saline，以無菌的塑膠接種環刮 取培養基表面產物並與 Page's ameba saline 混合均勻，以 1000 倍的油鏡觀 察其細部構造。若連續七天均未觀察到棘阿米巴生長之培養皿，則滅菌後 丟棄。
三、 核苷酸粹取及聚合酶反應
將培養好的蟲株用棉棒沾取調成懸浮液，離心去上清液，加入 600 µl lysis buffer (附錄四) 後置於水浴 55°C 40 分鐘，加入
phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)，離心 12500 rpm 5 分鐘，留上 層液。重複上個步驟一次後，加入 600 µl isopropanol 和 30 µl 0.85 % NaCl GTGAA) 及 reverse primer JDP2 (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGAGTCA) 來 amplify Acanthamoeba-specfic amplimer S1 (ASA.S1) region。ASA.S1 region 之大小約為 423~551 bp，位於 18S rRNA 之 936 bp 到 1402 bp 間 (Schroeder et al., 2001) (圖三 A)。此 amplify region 為 18S rRNA 二級結構 中的 stems E23-2 到-30，十二個高度可變區 (expansion segment) 中就佔了 三個 (Gast et al.,) (圖三 B) 。JDP1 primer 可與棘阿米巴 Rns 中之 E23-2' 及 E-23-6 結合。本實驗使用 892C primer (5'-GTCAG AGGTG AAA TTCT TGG) 當作 sequencing primer 來 amplify bp1271~bp1383，此 amplify region 包括了部分的 conserved stem 29 及 stem 29-1 全部，stem 29-1 為棘阿米巴
Rns 中之十二個高度可變區 (expansion segment) 之一。本實驗便是利用
stem 29-1 作為基因分型的依據 (Schroeder et al., 2001) 。Diagnostic fragment 3 (DF3) encodes Rns 中含高度可變區 stem 29-1 (Stothard et al., 1998; Schroeder et al. 2001) ，先前學者利用 DF3 將其所得 之 T3 、T4 型棘阿米巴之 Acanthamoeba-specfic amplimer S1 (ASA.S1) region 進一步再分型，T3 可再細分成五個亞型 (T3/1~T3/5)；T4 則可再細 分成十個亞型 (T4/1 ~T4/10) (Booton et al., 2002)。
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四、 DNA 定序及親緣分析 (Phylogenetic analysis)
將 PCR 產物跑電泳，電泳膠為 2％ agarose，在 500 bp 左右有 band 出現的 PCR 產物利用 PCR Clean Up Kit 將 DNA 純化出來。接著加入 892C primer (5'-GTCAG AGGTGAAA TTCTTGG) 送交國立台灣大學附設醫院 第二共同研實驗室，進行核酸序列分析。利用 ABI 3730 DNA Analyzer 進 行 DNA 定序。利用 Clustal W 軟體將所得的核酸序列與已知的核酸序列 (Stothard et al.,1998) (表二) 進行比對。再以 MEGA 4 軟體 (Molecular Evolution Genetic Analysis software ,ver 4; http://www.megasofware. net/
developed by S. Kumar et al., Arizona State University, Tempe, AZ)，使用 neighbor joining analysis、Kimura's (1980) two-parameter distance 計算參 數、1000 次的 bootstrap 值 (Felsenstein, 1985)，由兩兩基因序列置換的情 形來分析建構出所有可能接近真實的親緣樹。也使用 maximum parsimony analysis、1000 次的 bootstrap 值來分析並建構出 parsimony tree。
此外亦利用 Clustal W 將本實驗所得之 T3 、T4 型棘阿米巴之 ASA.S1 region 核酸序列與已知的 DF3 核酸序列比對進一步再分型 (Booton et al., 2002) (表三) 。