一、可可椰子採收後病害之調查
本研究首先於 2005 年 2 月至 2006 年 6 月間，發現產自屏東縣九如鄉、內埔鎮、
長治鄉等地的椰子果實，在採收數日後，常發生果蒂或果實傷口處褐化或黑化之 病變(圖二 A)，部分且伴隨有果肉黑化、腐爛、並帶有特殊水果香味之現象(圖二 B)，經取黑化果肉鏡檢，發現果肉組織中有大量深褐色卵形厚膜孢子；溼度高時 可發現黑化處表面有白色粉狀似孢子之物質(圖三)，取此部分鏡檢，則可見大量短 筒形，少數呈長筒形之透明分生孢子及長條形之壺狀孢子梗。因其病徵主要為黑 腐，故初步命名為可可椰子黑腐病。
圖二、田間發現果蒂處明顯黑化之可可椰子果實(A)，將此果實切開後所見果實內 部呈黑化病徵(如箭頭所示)(B)。
A B
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圖三、田間發現可可椰子果實傷口處(如箭頭所示)明顯褐化且出現白色似孢子之物 質(A)，將此果實切開後所見果實內部皆已黑化(B)。
另於 2005 年 5 月至 2006 年 6 月間，作者即在台中市某椰子大宗販賣業者處，
每日觀察並記錄上述病害之發生情形，主要係針對所有剖取椰子水後之可可椰子 果實殘體，檢視其病徵，並記錄所屬批號之產地、採收日期、發病百分率等。
依據上述病變及病徵，乃將此一病害發病嚴重度分成 4 級，以利疾病嚴重度 之量測與量化，茲分述如表一：
表一、可可椰子果實黑腐病罹病度(Disease index)之分級對照表。
級別 病徵描述*
0 無任何病徵，或果實外果皮黑化，但中果皮不黑化。
I 外果皮及中果皮皆發生黑化，但深度未達中果皮之 1/2。
II 外果皮及中果皮皆發生黑化，但深度達中果皮之 1/2 以上，未及內果 皮。
III 外果皮及中果皮皆發生黑化，且深及內果皮處，但未超過內果皮。
IV 外果皮及中果皮皆發生黑化，且深度超過內果皮。
*除罹病度 0 以外，其他各級罹病度之判定，皆須將果實縱切觀察之。
依據表.之罹病度分級表，對於採收後之可可椰子果實，乃可依照以下公式，
測定全批果實之疾病嚴重度(Disease severity index, DSI)：
B A
疾病嚴重度= (Σ(各果實罹病級數) / 4×統計果實總數) × 100%
為比較各批椰子果實發病率之差異，乃將各日觀測所得，依照其進貨批次進 行分析統計並記錄其採收後儲存之日數，所得數值再經由 LSD 檢測(STATISTIX ver2.0 for Windows)以探討不同批次、月份及採收後日數，是否有發病程度之差異。
二、可可椰子黑腐病病原菌株之分離及鑑定
病源之分離係將前述帶有病徵的椰子，沿病徵處切開，以滅菌刀具挑取病健 交界部位切取小塊，並立即以 1.5%次氯酸鈉水溶液(Sodium hypochloride)消毒約 10~30 秒後，置於 2% PDA 或 2% WA 平板培養基上進行常溫培養。又若發現病果 表面有明顯之產孢，則直接挑取孢粉進行單孢分離，亦於 2% PDA 或 2% WA 平板 培養基上進行常溫培養。待 3~4 日後有菌絲長出時，則切取菌絲尖端進行單絲分 離；若分離所得菌株有產孢現象，則進行單孢分離予以純化。經此過程純化、確 認無其他微生物污染之菌株，即將其培養於 2% PDA 或 2% WA 平板培養基上，用 以進行後續之鑑定或病源性檢定等相關試驗。
依上述方法分離所得的分離株，皆依照其在 2% PDA 平板培養基上之培養形 態、鏡檢下所見之分生孢子、厚膜孢子、分生孢子梗等形態進行鑑定，其鑑定依 據主要為各菌株之形態、構造及大小，並依據相關鑑定圖說書籍鑑定至屬及種 (Barnett and Hunter, 1972; Upadhyay, 1981)。
在菌株保存方面，作者發現以 PDA 平板或斜面保存上述之分離菌株，極易受 到蟎類之入侵與污染，故在短期保存上，均以培養於 1.5%或 2% WA 平板培養基之 方式進行保存，此法可維持菌株活性約 1~2 個月，且不易遭受蟎類之污染。而在 長期保存上，則使用螺旋試管，各裝填 2% WA 10ml 及 1g 砂土，經混合、高壓滅 菌後，接種菌株進行保存，此法可維持菌株活性達 1 年以上。
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二，其一為使用打孔器在中果皮切面打直徑約 0.5cm，深約 1cm 之圓洞，再自培養 基中以打孔器挖取相同直徑之菌絲塊，塞入打出之孔洞中，再將打孔器挖出之中 果皮塞回原處完成接種。另一為取一大小約 0.5 公分之菌絲塊，直接置於乾淨新切 開之中果皮切面上，即完成接種。接種完成後，即將果實切面置於保濕環境下，
並每日觀察病勢之發展，接種 3 日後即將此果實切面沿果頂再縱切，以確認切面 內部是否受到感染。
四、可可椰子黑腐病菌株孢子發芽特性之觀察
（一）可可椰子黑腐病菌株分生孢子發芽特性之觀察
在本研究分離菌株之過程中，發現菌株孢子在發芽時會有特殊之構造產生，
且似乎受到養分及微氣候所左右，故進行以下孢子發芽特性之觀察試驗。本試驗 共選取 3 株菌株進行之，包括 TP-05W、TP-06 及 TP-27，其中 TP-27 為正常野生型 菌株，而 TP-06 為不產生厚膜孢子變異株、TP-05W 為白化變異株。試驗所使用之 分生孢子皆取自培養 24 小時之 PDA 平板培養基，並以滅菌移殖環從菌落中取得。
孢子塗抹於 PDA 平板培養基、WA 平板培養基或空白玻片上的水滴，均勻塗抹後，
即以滅菌蓋玻片蓋住部分塗抹處，以模擬受水膜覆蓋而缺氧之環境，將其放置於 室溫下數天，觀察其發芽之形態，並計數孢子發芽率與不同發芽形態所佔之比率，
唯空白玻片加水滴部分需置於加濕培養皿中保濕。
（二）可可椰子黑腐病菌株厚膜孢子發芽特性之觀察
本試驗所用菌株與處理方式同上述分生孢子發芽特性觀察試驗者，已知該菌 分生孢子多屬氣生，而厚膜孢子則非全為氣生，厚膜孢子之取得方式係參考 Ko et al.(2001)，將培養約一週之 PDA 平板培養基菌落翻倒於白紙上，再以刀具自底部割 取帶有厚膜孢子之瓊脂塊後將其絞碎以釋出厚膜孢子。將釋出後的厚膜孢子以移 殖環塗抹於 PDA 平板培養基、WA 平板培養基或空白玻片上的水滴，均勻塗抹後，
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即以滅菌蓋玻片蓋住部分塗抹處，以模擬受水膜覆蓋而缺氧之環境，將其放置於 室溫下數天，觀察其發芽之形態，並計數孢子發芽率與不同發芽形態所佔之比率，
唯空白玻片加水滴部分需置於加濕培養皿中保濕。
五、可可椰子黑腐病病原菌株有性世代之誘發
Thielaviopsis paradoxa 之 有 性 世 代 Ceratocystis paradoxa 為 異 宗 親 和 性 (heterothallic)真菌，意即其有性世代之誘發，必須由不同交配型(mating type)菌株，
以對峙培養的方式始能誘發(Dade, 1928)。有關本病菌有性世代的誘發係以前述分
離所得之T. paradoxa菌株約 20 株，因尚未了解其配對標準，故先以其中培養形態
差異較大之二菌株 TP-05W、TP-03 作為配對代表，並選用加有滅菌椰子果皮之 PDA 平板培養基，進行兩兩配對之對峙培養，在室溫放置一至兩個月後即以解剖顯微 鏡鏡檢，觀察是否有長喙子囊殼之產生。若發現有長喙子囊殼及子囊孢子之存在，
即將其產生之子囊孢子進行單孢分離，並將子囊孢子單胞養成之菌株予以編號，
以進行其他之試驗。
六、溫度對可可椰子黑腐病菌株生長速度之影響
本項生長速度之實驗係將經病原性檢定測知具有病原性之菌株，先培養於 PDA 平板培養基上 1 天，再取菌絲塊移殖到 9cm PDA 平板培養基上進行試驗，測 試溫度為 10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 6 級，並每日量測菌絲生長之半 徑。供測之菌株有 11 株，每株每一溫度至少 2 重複。由於菌株在部分溫度下生長 過快，故部份觀察之間隔縮短為每 6 小時一次，但最後結果皆以每日公分數表示 之。
七、溼度對可可椰子接種黑腐病菌後發病嚴重度之影響
本試驗中果實之接種與前述以孢子懸浮液對可可椰子全果實進行接種之方法
相同，測試菌株選定 TP-06，溼度測定係使用乾濕球溫度計。在以孢子對果蒂接種 後，即將果實分別置於 3 種溼度中，包括相對溼度達 100%之濕室、相對溼度 70~75
％之實驗室及相對溼度約 30~35%之防潮箱中，觀察並記錄病勢之發展，每一處理 為 3 顆果實，接種 10 日後並以刀具將果實縱剖，觀察並記錄果實內部之病勢發展 情形，藉以比較不同溼度對發病嚴重度之影響。
八、可可椰子黑腐病菌株寄主範圍之測定
（一）可可椰子黑腐病菌株對甘蔗苗之病原性檢定
甘蔗苗係自南投埔里地區某一蔗農處取得，為甘蔗莖頂部約 20 公分之節段 苗。待試菌株預先培養於 PDA 平面培養基上一週，使其大量產生厚膜孢子。甘蔗 栽培介質為根基旺與荷蘭 BVB 介質依 1:1 比例混合而成，經稀釋平板法測定此一 介質中並不含有任何 Thielaviopsis 屬真菌。接種方式為將待試菌株培養於 PDA 平 板培養基，一周後將之切成大小約 0.5 cm × 0.5 cm 之菌絲塊，每皿之菌絲塊與 2 公 升之栽培介質均勻混合後倒入長條砵，再將蔗苗以橫躺之方式，半埋於栽培介質 中，每一菌株皆接種三支蔗苗，並取不含菌體之 PDA 平板培養基作對照組處理。
接種完成後將盆土澆濕，置於室外陽光充足處，並定期澆水以維持土壤溼度。接 種一個月後即觀察蔗苗發芽率與生長情形，並將蔗苗縱剖以觀察切面是否有感染 之發生。
（二）可可椰子黑腐病病原菌株對鳳梨果實之病原性檢定
鳳梨果實係自台南關廟地區鳳梨果農處購得，品種為台農 17 號(品種名為＂金 鑽鳳梨＂)，於接種前先將果實表面以 75%酒精噴施以進行表面消毒，果柄處則以 95%酒精浸泡數秒鐘消毒之。待試菌株孢子懸浮液之製作為取約 5ml 之無菌水，倒 入已培養菌株約 3 日之 PDA 平板培養基中，並以 L 型玻棒輕輕刮取培養基表面，
吸出含有大量分生孢子及厚膜孢子之懸浮液，再以血球計數器定量總孢子濃度，
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並將濃度調整為 1×105孢子/ml。接種時取消毒完成之果柄，以滅菌之刀具橫切出無
並將濃度調整為 1×105孢子/ml。接種時取消毒完成之果柄，以滅菌之刀具橫切出無