2.1 細胞株培養
實驗使用兩種不同細胞株，一是 HeLa Cell（人類子宮頸癌細胞），以Eagle's minimal essential medium（EMEM）外加 10% Fetal Bovine Serum（FBS，
GIBCO ）、 PSA （ Antibiotic-Antimycotic ， Invitrogen ）、 L-Glutamine
（GlutaMAX™，Invitrogen）作為培養基；二是 PC9 Cell（人類肺癌細胞）
以Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）外加 10% Fetal Bovine Serum
（FBS，GIBCO）、PSA（Antibiotic-Antimycotic，Invitrogen）、L-Glutamine
（GlutaMAX™，Invitrogen）作為培養基。培養在 37℃、5% CO2的培養箱 中。
2.2 Genomic DNA 萃取
收九成滿的 10 公分盤細胞作為萃取的材料，吸除盤中培養基後，以 1X PBS 去除殘留培養基後，加入1X Trypsin 1mL，37℃靜置 5 至 15 分鐘，隨後立 即加入兩倍體積的培養基中和反應。吸取細胞混合液到 15mL 離心管，以 800rpm、4℃離心 5 分鐘後，小心移除懸浮液，利用管中殘留液體將 pellet 打散，再加入3mL 的 cell lysis buffer 混合均勻置於室溫 20 分鐘，等待細胞 溶解，緊接著加入1mL 的 protein precipitation buffer，震盪 20 秒混合均勻後，
以13,000g 離心 10 分鐘，此時，蛋白質與細胞碎片會沉積至管底形成 pellet，
而DNA 則存於上清液中。取新管加入 3mL 的 isopropanol，離心好的上清液 取至新管，借由上下翻轉離心管約 50 次把 DNA 沉澱出來，13,000g 離心 3 分鐘形成DNA pellet，再用 70%酒精清洗 pellet，隨後清除酒精風乾 3~5 分 鐘，以30~50μl 二次水回溶，存於-20℃。
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2.3 RNA 萃取
以 6-wells 盤的一格（細胞約九成滿）做為 RNA 萃取的材料，加入 1mL 的 TriPure reagent（Roche），置於室溫 5 分鐘等待蛋白質分解，隨後加入 chloroform（氯仿）震盪 15 秒後，置於室溫 10 分鐘後 12,000g、4℃離心 15 分鐘，此時管中液體會分成三層，由上至下依序是含有 RNA 的水層與含有 DNA 及 proten 的中間層與有機層。將含有 RNA 的水層移至新管，加入 0.5mL 的isopropanol（異丙醇）後，上下翻轉離心管將 RNA 沉澱出來，以 12,000g℃
離心10 分鐘，去除上清液並用 75%酒精清洗 RNA pellet，隨後去除酒精風 乾3~5 分鐘，以含有 DEPC 的二次水回溶，存於-80℃。
2.4 Reverse Transcription
採用 QuantiTect Reverse Transcription Kit（QIAGEN），先將RNA 放在冰上 回溫溶解，配製Genomemic DNA Elimination Buffer，隨後加入 1μg RNA，
置於42℃下 2 分鐘後，立即放回冰上，配製 reverse-transcription master mix
（依產品說明），將冰上的RNA 混合液加入 master mix 中，置於 42℃下 15
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採用LightCycler system（Roche），利用SYBR Green 會鑲嵌在雙股 cDNA 或DNA 的特性，再藉由機器偵測 BYBR Green 的螢光量來測定 RNA 的表 現量。在反應管中各加入等量的 HeLa 與 PC9 之 cDNA，由於表現量與 Ct 值成反比，也就是說，隨著PCR 的循環次數增加，target DNA 也會迅速增 幅，當螢光超過閥值（Threshold）時所對應的 Cycle 數就是 Ct 值，表現量 越多，Ct 值越小，用此偵測細胞內甲基轉移酶 I（Methyltransferase I，DNMT 1）的表現量，在氧化壓力（ROS）前後是否有差異。
2.8 Pyrosequencing
為能精準的偵測粒線體 DNA 的甲基化程度，實驗採用焦磷酸定序法
（Pyrosequecing，PyroMark Q24，QIAGEN），利用PCR 時 DNA 聚合酶（DNA Polymerase）會與去氧核苷酸（dNTP）結合，釋放出焦磷酸根離子（PPi），
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隨後三磷酸腺苷硫酸化 （ATPsulfurylase）會將 PPi 與腺苷磷酸硫酸（adenosine phosphosulfate: APS）轉換成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate: ATP），而 ATP 則會提供 Luciferase 能量激發冷光，再藉由 CCD 偵測達到定量的目的。
該技術是ssDNA-base 的定序方式，因此需要一支 5'標記 Biotin 的 primer，藉 由PCR 放大產物的同時順便將 Biotin 也加在欲分析的產物上，此後，利用高 溫下可將 dsDNA 解開的原理讓雙股分開，再以磁珠吸取 5'標記 Biotin 的 ssDNA 作為定序分析的模板（Template）。
2.9 Bisulfite Conversion
甲基轉移酶（Methyltransferase）會針對 CpG site 上的胞嘧啶（Cytosine）
環上的第五個碳加甲基（Methyl Group），使得 Cytosine 變成 5'-甲基胞嘧啶
（5'-methylcytosine）。而亞硫酸鹽（Bisulfite）這種化學藥品，可以將 Cytosine 透過脫胺（Deamination）的反應轉換成尿嘧啶（Uracil），隨後進行PCR 時，
Uracil 又 會 被 轉 換 成 胸 腺 嘧 啶 （ Thymidine ）； 反 之 ， 甲 基 化 後 的 5'-methylcytosine 則不會被轉換，經過定序時仍然為 Cytosine，藉此即可以分 析該位點是否被甲基化，故Bisulfite Conversion 可說是分析甲基化最常用且 重要的技術。本實驗採用EZ DNA Methylation Kit（ZYMO RESEARCH），
經過亞硫酸鹽轉換後的DNA 會透過 PCR，增幅放大欲研究的基因片段，為 提升PCR 的精準度與達到足夠的產量，通常會使用具有 Hot-Star 功能的 DNA Polymerase（PyroMark PCR Kit，QIAGEN），並且將 PCR 的循環次數調整至 40~45 次。
11 變。實驗測定HeLa cell 的範圍包括：ATP6、ND1、ND6、D-loop 與 TERM 等5 個區域，結果顯示，以 0.4mM H2O2處理30 分鐘後這 5 個區域的甲基化