一代的。綜文獻所知，以下幾個機制都包含在 Epigenetic 裡：DNA 甲基化
（DNA methylation）、組蛋白修飾（histone modification）、非編碼 RNA
（non-coding RNA）。本研究則聚焦在 DNA 甲基化的部分。
DNA 甲基化在生物體中是一個自然的現象，不僅在原核生物會發生，真 核生物也不例外。原核生物 DNA 的甲基化目的是在當受到外來 DNA 入侵 時，保護自己的DNA 免於被自身之限制酶（restriction enzyme）切割破壞，
而外來 DNA 因為沒有甲基化的保護則會被限制酶切割破壞，達到防禦外來 DNA 的目的。更進一步，真核生物的 DNA 甲基化則是與調控基因表現有關
3。隨研究發展日新月異，近年來更認為真核生的 DNA 甲基化在基因印痕
（gene imprinting）、胚胎發展（Embryonic development）、X 染色體失活
（X-chromosome inactivation）、癌化（oncogenesis）1 與基因沉默（gene silencing）上扮演重要的角色，無疑的，DNA 甲基化在上位遺傳調控的領域 裡，提供了穩定且可遺傳的重要元素2。
DNA 甲基化多發生在 5'- CpG- 3' site 的 Cytosine 上，DNA 序列中部分區 域富含CG 時，此區域則被稱為 CpG 島（CpG island）2當這些區域發生甲基
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在哺乳類動物中，由 DNA methyltransferase（DNA 甲基轉移酶，DNMT）
執行甲基化的工作，其作用的機制是利用 S -腺苷基甲硫氨酸（S-adenosyl
DNMT3 與 DNMT2。DNMT1 是最大宗的甲基轉移酶，分子量約 183 kDd，
基因位於第 19 對染色體 p12~13 處主要的功能在於維持（mantain）既有的 甲基化模式 6，其活性相較於其他甲基轉移酶在體內更為活躍。DNMT1 會 針對半甲基化的DNA（hemimethylated DNA），只要一股是 CpG，而相對的 另一股是 C，即使 DNA 出現不正常的結構或序列，DNMT1 依舊會進行甲 基化，這樣寬鬆的辨識條件讓DNMT1 可以迅速的完成維持甲基化模式的工 作 1，同時、這種維持作用可以將 DNA 甲基化資訊傳遞給子代細胞。而 DNMT3 家族有三個成員：DNMT3a、DNMT3b 及 DNMT3L。其中 3a 和 3b 的基因則分別位於染色體2p23 與 20q11.2 上，主要功能在新生（de novo）
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甲基化模式 7，這在胚胎發育早期與配子生成（gametogenesis）的過程中扮 演重要的功能，其次，DNMT3L 目前被認為是一個輔助性蛋白，結構與 DNMT3 類似但缺乏 C 端的催化活性區，因此於法自行執行甲基化，但透過 與3a、3b 的交互作用，可能參與轉錄抑制的反應（transcriptional repression）。 第三型DNMT2，又稱 TRDMT1（tRNA aspartic acid methyltransferase 1）在 2006 年被發現是人類體內第一個針對 RNA 甲基化的酵素8，所以本質上並 不屬於DNA 甲基轉移酶。
由於 DNMT1 負責了多數甲基化的工作，相關研究也較發達，事實上 DNMT1 也具有幾個不同的 isoform，DNMT1b 是源自於 transcript variant，比 DNMT19少一個exon ，其蛋白質表現量約佔 DNMT1 的 2~5%；更令人感到 興 趣 的 是 2011 年屬於粒線體的 DNA 甲基轉移酶被發現，被命名為 Mitochondrial DNMT1（mtDNMT1），其結構與 DNMT1 相同只是在蛋白質 的 N 端（N-terminal）多了一段粒線體導引序列（mitochondrial targeting sequence ， MTS ）。 和 DNMT11 不 同 ， mtDNMT1 使 用 的 轉 譯 起 始 點
（translational start site）並非大家了解的起始點而是自原本的起始點又向前 位移一個。據研究顯示，粒線體導引序列經多物種的序列比對分析後發現，
在哺乳類中是一段高度保留的序列（conserved sequence）10，當DNMT1 有 這段序列後，便會被帶到粒線體去出現在粒線體的基質裡（matrix）。另外，
若 細 胞 處 於 氧 化 壓 力(oxidative stress) 的 狀 態 下 會 導 致 peroxisome proliferator-activated receptor γ-coactivator1α (PGC1α) 以 及 nuclear respiratory factor 1 (NRF1) 表現上升，並進一步使 transcription factor of activated mitochondria (TFAM) 和 粒 線 體 呼 吸 鏈 複 合 體 (mitochondrial respiratory chain complex)的成員表現上升11。另先前之研究分別或者同時轉 染PGC1α 及 NRF1 進入 HCT116 細胞株，且觀察到 mtDNMT 的蛋白表現 增加，並導致粒線體上的基因表現量有所變化。這也意指著粒線體有其專屬
4 phosphorylation）產生 36 個 ATP 成為細胞能量主要的來源。但在粒線體功能 異常與低壓氧（hypoxia）時，丙酮酸則會選擇另一條途徑進行無氧呼吸，被 細胞質中的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）轉換成乳酸（lactic acid）排 出細胞外，並產生2 個 ATP12。在以上一系列過程中還會直接或間接產生：
乙醯輔酶A（acetyl-CoA）、S -腺苷基甲硫氨酸與（SAM）、煙醯胺腺嘌呤二 核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），acetyl-CoA 和 NAD+是 細胞內重要的輔酶參與醣解作用、葡萄糖新生（gluconeogenesis）、脂肪酸分 解（β-oxidation）等重要反應；而 SAM 則是細胞內甲基的主要供應者影響細 胞甲基化程度13，由此可知，粒線體在體內扮演非常重要的功能。
粒線體是唯一具有自己 DNA 的胞器，根據 1981 Anderson 等人的研究知道 人類的粒線體DNA（mtDNA）長度約 16,569 bp，為一雙股環型結構，外側 的一股有較多的基因，稱作重股（heavy strand），內側的一股基因較少，稱 作輕股（light strand），雖然多數出現在粒線體內的蛋白質是由細胞核所做 的，但粒線體DNA 上卻有著 rRNA 與 tRNA 的基因，使得粒線體也擁有與 細胞質內不同的轉譯系統（translation system）14。總體來說，粒線體 DNA
5 是被粒線體的轉錄因子（mitochondrial transcription factor A，TFAM）高度保 護，無法被甲基化，這也顯示了粒線體 DNA 被甲基化的程度會因區域功能 不同而有差異 18。隨後 Shock 等人也在 2011 年發現了屬於粒線體的甲基轉 移酶，且發現細胞同時轉染 PGC1α 及 NRF1 以模擬氧化壓力時 mtDNMT1 表現亦會上升，同時用抗體偵測粒線體 DNA 上不同基因，發現 mtDNMT 在個基因有不同程度的結合力。基於以上之成果，本研究將比較細胞在一般 跟氧化壓力的環境下，mtDAN 甲基化程度之差異。因此以 bisulfite conversion 處理mtDNA 後，再以焦磷酸定序法（pyro-sequencing）針對 mtDNA 作區域 性的分析，如此可以達到用更直接且更靈敏的方式偵測 CpG site 或 CpG
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island 上 cytosine 被甲基化的改變。同時，我們也想要進一步了解 mtDNMT 1 的表現量是否與 mtDNA 的甲基化相關，且其作用機制為何，最後，mtDNA 的甲基畫是否會對細胞造成影響。
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