2-1 材料與儀器 2-1-1.試藥：
檳榔鹼，Arecoline‧HBr (Acros，Beigium)
穀胱甘肽，L-Glutathione reduced，Glutathione (Sigma-Alorich，USA) 氯化鉀，KCl (Merck，Germany)
氫氧化鉀，KOH (Merck，Germany) 鹽酸，HCl (Merck，Germany)
醋酸鈉，Sodium acetate， CH3COONa‧3H2O (Merck，Germany) 醋酸，Acetic acid (Merck，Germany)
磷酸，Phosphatic acid (Merck，Germany)
磷酸氫二鈉，di-Sodium hydrogen phosphate， Na2HPO4‧2H2O ，(Merck，
Germany) 氫氧化鈣，Calcium hydroxide，Ca(OH)2) (Merck，Germany)
正庚基磺酸鈉塩，1-Heptane sulfonic acid sodium salt，PIC-B7 (Merck，
Germany)
Ethyenedinitrilo teracetic acid disodium salt dihyarate，EDTA (Merck，
Germany)
O-phthaldehyde，OPT (Merck，Germany)
甲醇，Methanol (Merck，Germany) 乙腈，Acetonitrile (Merck，Germany) Imidazole (Merck，Germany)
甲酸，HCOOH (Merck，Germany) 純水，Mini-Q Pure water (Home maker)
pH=6.0~10.0 磷酸緩衝溶液：
(1) 各秤取磷酸氫二鈉 0.05M 約 8.90 g 溶於 80 ml Milli-Q 純水中。
(2) 以 10%磷酸溶液分別調整至 pH 6.0±0.05；7.0±0.05；8.0±0.05；
9.0±0.05；10.0±0.05。
2-1-3-3.移液吸管 (Transferpette) 廠牌：BRAND
型號：100~1000ul
2-1-3-4.加熱攪拌器 廠牌：Frago 型號：HMS-102
2-1-3-5.高效能液相層析儀( High Performance Liquid Chromatography ; HPLC)
2-1-3-5-1.廠牌：SHIMADZU
系統控制器 (System controller) 型號：SCL-10A 自動注射器 (Auto injector) 型號：SIL-10A 幫浦 (Pump) 型號：LC-10AD
紫外光-檢測器 (UV-VIS detector) 型號：SPD-10A 層析管 (Column) 廠牌：E-Merck
型號：Puroshere RP-18(5 um), 250 x 4 mm 2-1-3-5-2.廠牌：HITACHI
幫浦(Pump) 型號：L-2130
光二極體陣列檢測器(Photo Diode array detector) 型號：L-2450 微量注射器(Microinjector) 廠牌：HAMITO
型號：Microliter -25ul 層析管(Column) 廠牌：E-Merck
型號 : LichroCART CN(5 um), 250 x 4 mm
2-1-3-6.螢光光度計 (Spectrofluorophotometer) 廠牌：SHIMADZU
型號：RF-1501
2-1-3-7.超純水製造機 (Water purification systems) 廠牌：MILLIPORE
型號：Milli-Q
2-1-3-8.減壓濃縮機 (Rotary Evaporator,) 廠牌：PANCHUM quadrupole mass spectrometer )
2-1-3-10-1. HPLC 廠牌：Agilent
幫浦(Pump) 型號：Agilent 1100 G1312A
自動注射器 (Auto injector) 型號：Agilent 1100 G1329A 層析管保溫箱 (Column oven) 型號：Agilent 1100 G1316A 層析管(Column ) 廠牌：SUPELSILTM
型號：LC- CN (3um), 150 x 2.1 mm 2-1-3-10-2.質譜儀 Mass Spectrometer
廠牌：AB Sciex Intruments 型號：API 4000 2-2 實驗方法
2-2-1. 檳榔鹼與穀胱甘肽之間的交互作用：
為了瞭解在不同pH 值中 Arecoline 與 Glutathione 之間交互作用所產生 含量變化的情形，將等濃度的 Arecoline 與 Glutathione 分別置於不同 pH 值 (範圍分別為 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 12.0)之緩衝溶液中，並於 37℃水浴鍋中反應 20 分鐘，再分別利用 HPLC 及螢光光度計測量 Arecoline 與 Glutathione 的量。
方 法 ：(1). 秤 取 等 莫 耳 濃 度 (5.0 μ mole/ml) 的 Arecoline (HBr salt) 和 Glutathione 置於三角錐瓶中，並溶於已配製好不同 pH 值之緩衝 溶液中。
(2).將裝有混合液的三角錐瓶置於 37℃水浴鍋中反應 20 分鐘。
(3).反應終了時加入 1N HCl 使之終止反應。
(4).Arecoline 和 Glutathione 分別使用高效能液相層析儀和螢光光度 計進行定量分析。
(5).另外再以上述相同的方法，分別將 Glutathione 單獨在各種不同的 pH 緩衝液不加 Arecoline 中進行反應，最後再進行 Glutathione 的
含量測定。
由於Arecoline 本身即含有少量之 Arecaidine，所以同時測定 Arecoline 和Arecaidine 的含量：
儀器： 利用 HPLC (LC 10AD,SHIMADZU) 配備自動注射器 層析管： Puroshere RP-18(5μm), 250 x 4 mm (E-Merck) 檢測器：UV 檢測器
由於 Glutathione 在 UV 215 nm 下並無吸光值，故利用螢光光度計來 檢量其含量。
儀器：螢光光度計(Spectrofluorophotometer RF-1501,Shimadzu)
方法：(1).吸取 0.1 ml 的反應液，以 pH=2.0 之氯化鉀-鹽酸緩衝溶液稀釋定 量至10 ml。
(2).再吸取上述(1)之稀釋液 0.1 ml 加入 1.8 ml pH=8.0 磷酸緩衝溶液 (內含有 5 mM EDTA),混合均勻 , 再加入 0.1 ml
OPT(o-phthaldehyde;1 mg/ml, MeOH),於室溫中靜置 15 分鐘。
(3).再將反應液放入螢光光度計中使用波長 350 nm 至 420 nm 測量螢 值在酸性的範圍中 Arecoline 消耗 Glutathione 的量是相當少量，甚至在 pH 值小於 5.0 時 Areceoline 與 Glutathione 幾乎是沒有反應的，當 pH=8.0~9.0 時 Arecoline 所消耗掉 Glutathione 的量最多，而在偏強鹼性的 pH=12.0 時
Arecoline 所消耗掉 Glutathione 的量比在弱鹼性 pH=8.0 時要來的少。所以 分別選擇在pH=8.0 和 12.0 緩衝溶液中觀察 Arecoline 和 Glutathione 交互作 用的動力反應情形。
方 法 ：(1). 稱 取 等 莫 耳 濃 度 (5.0 μ mole/ml) 的 Arecoline (HBr salt) 和 Glutathione 裝有三角錐瓶中並分別溶於 pH=8.0 之磷酸緩衝溶液 和 pH=12.0 之氫氧化鈣飽和溶液中。
(2).將裝有混合液的三角錐瓶置於 37℃水浴鍋中反應。
(3).分別在反應第 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 和 60 分鐘時，用移液吸管 吸取0.1 ml 反應液進行 Arecoline、Arecaidine 和 Glutathione 的含 量測定。
(4).另外再單獨稱取 5μmole/ml 的 Arecoline 分別溶於 pH=8.0 之磷酸 緩衝溶液和 pH=12 之氫氧化鈣飽和溶液中不加 Glutathione 進行上 述(2)及(3)的反應及測定 Arecoline 和 Arecaidine 的含量。
2-2-3. 檳榔鹼與穀胱甘肽在 pH=8.0、10.0 及 12.0 緩衝溶液中加成物之分離 純化與分析：
為了證明Arecoline 與 Glutathione 之間在鹼性的條件下反應會有加成物 產生，故分別在 pH=8.0、10.0、12.0 緩衝溶液中進行交互作用反應並利用 配有光二極體陣列檢測器的HPLC 進行反應加成物分析。
方 法 ：(1). 秤 取 等 莫 耳 濃 度 (5 mmole/ml) 的 Arecoline (HBr salt) 和 Glutathione 置於三角錐瓶，分別溶於 pH=8.0、10.0 之磷酸緩衝 溶液中；pH=12.0 則溶於氫氧化鈣飽和溶液中。
將實驗2-2-5 在不同 pH 值中純化分離出來之加成物，利用 LC-MS-MS
質譜儀：(API 4000, AB Sciex Intruments) 掃瞄範圍：100~600 m/z,amu
掃瞄頻率：0.4 sec 溫 度：450℃
2-2-4-2.MS/MS 之檢測：
質譜儀：(API 4000, AB Sciex Intruments) 掃瞄範圍：pH=8.0 之加成物：463 m/z,amu
pH=10.0 之加成物：420 m/z,amu
pH=12.0 之加成物：449 m/z,amu 掃瞄頻率：0.4 sec 掃瞄溫度：450℃