3-1. 檳榔鹼與穀胱甘肽之間的交互作用：
為了瞭解在不同酸鹼度中 Arecoline 與 Glutathione 之間交互作用所產生 含量變化的情形，所以將等濃度的 Arecoline 與 Glutathione 分別置於不同 pH 值(範圍分別為 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 12.0)之緩衝溶液中，並 於 37℃水浴鍋中反應 20 分鐘，再分別利用 HPLC 及螢光光度計測量 Arecoline 與 Glutathione 的量。
3-1-1. 檳榔鹼和檳榔次鹼的含量測定：
利用 HPLC 進行 Arecoline 和 Arecaidine 的含量測定結果發現：
Arecaidine、內部標準品 Imidazone 和 Arecoline 滯留時間分別為 1.957min、
2.601min 和 4.119min(圖 4)。依不同濃度標準溶液分析 Arecoline 和 Arecaidine 其 所 得 之 檢 量 線 皆 呈 直 線 之 線 性 關 係 ， 相 關 系 數 分 別 為 r=0.99988 (圖 5)及 r=0.99994 (圖 6)。
3-1-2.穀胱甘肽的含量測定：
利用螢光光度計測量 Glutathione 與 OPT 所形成螢光物質的吸收強 度，再由 Glutathione 標準溶液檢量線換算出 Glutathione 的含量，其所得 之檢量線皆呈直線之線性關係，相關系數分別為 r2=0.9995(圖 7)。
由以上 Arecoline 與 Glutathione 含量測的結果發現當 pH 值在酸性的範 圍中 Arecoline 消耗 Glutathione 的量是相當少量，甚至在 pH 值小於 5.0 時 Arecoline 與 Glutathione 幾乎是沒有反應的，當 pH=8.0~9.0 時 Arecoline 所 消耗掉 Glutathione 的量最多，而在偏強鹼性的 pH=12.0 時 Arecoline 所消耗 掉 Glutathione 的量比在弱鹼性 pH=8.0 時要來的少(圖 8)，又當 Glutathione 單獨在各種不同的pH 值緩衝液不加 Arecoline 中進行反應，進行 Glutathione 的含量測定結果發現 Glutathione 的含量在各種不同的 pH 值緩衝液並無明 Arecoline 與 Glutathione 之間交互作用的實驗所產生含量變化的情形中發 現，當 pH=8.0~9.0 時 Arecoline 所消耗掉 Glutathione 的量最多，而在偏強 鹼性的 pH=12.0 時 Arecoline 所消耗掉 Glutathione 的量比在弱鹼性 pH=8.0 時要來的少。所以分別選擇在 pH=8.0 和 12.0 緩衝溶液中觀察 Arecoline 和 Glutathione 交互作用的動力反應情形。結果發現在含有 Glutathione 在 pH=8
的反應液中Arecoline 的含量會隨著反應時間增加而呈現出很快且較多量的 Glutathione 之間在 pH=8.0、10.0、12.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所 產生的加成物，由層析圖中得知 Arecoline 與 Glutathione 加成物滯留時間在 pH=8.0 時為 6.62 分鐘(圖 13)、在 pH=10.0 時為 4.55 分鐘(圖 14)、在 pH=12.0 463m/z [Adduct]+，分別出現334m/z [Adduct－Glutamate]+、188m/z [Adduct
－GSH＋S]+、156m/z [Adduct－GSH=Areoline]+ (圖 19)。故推測 Arecoline
與 Glutathione 在 pH=8.0 緩衝溶液中加成物之分子量有可能是 463m/z。 析加成物 449m/z [Adduct]+，分別出現 320m/z [Adduct－Glutamate]+、176m/z [Adduct－GSH＋S]+ (圖 23)。故 Arecoline 與 Glutathione 在 pH=12.0 緩衝溶 液中加成物之分子量可能是449m/z[Adduct]+。
3-4-3.在 pH=10.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物：
在 pH=10.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，層析圖譜在 13.97 分鐘及 17.67 分鐘有波峰出現(圖 23)，其 質量□片在 463m/z、449m/z、420m/z 均有波峰出現 (圖 25,26)。故推測 Arecoline 與 Glutathione 在 pH=10.0 緩衝溶液中加成物之分子量 463m/z、
449m/z、420m/z 皆有可能是其反應的加成物。再由 MS/MS 分析加成物 420m/z [Adduct]+，分別出現145m/z [Adduct－GSH＋S]+、114m/z[Adduct－
GSH]+ (圖 27)。
第四章 討 論
在過去衆多研究與實驗中，均已證實檳榔成分中之 Arecoline 會造成細 胞的癌化現象，而 Arecoline 將細胞內 Glutathione 含量消耗掉與癌化的機轉 有關，由本實驗中再次得到證實。
此外，在 LC/MS/MS 方法分析中，由第一次撞擊所得結果顯示，在不 同 pH 值緩衝溶液中所形成的反應加成物其主要的斷片質量亦有所不同。綜 合一次及二次撞擊所得的主要斷片質量數據，顯示至少有三種不同的加成 物在其交互作用之反應中形成。
過去的研究中也曾探討過 Arecoline 的代謝產物即為 Arecoline 與 Glutathione 加成物，只是早期是利用濾紙色層析析法、紅外線光譜儀來確 認代謝物之分子式(17)。拜科技進步之賜，本實驗利用 HPLC 及配有 Diode array detector 並具定性及定量的功能，能正確將加成物分離出來；再配合 串聯式液相層析質譜儀能更精確的測定出加成物的分子質量。所以對於探 討在不同 pH 值中 Arecoline 與 Glutathione 交互作用的反應程序有實質上的 幫助。
第五章 結 論
在
不同酸鹼值中，Arecoline 與 Glutathione 之間交互作用及動力反應實 驗中，結果均顯示Arecoline 的確會將 Glutathione 的量消耗掉，且是在 pH=8.0 弱鹼性的環境下消耗 Glutathione 的量最多。在 pH>10.0 強鹼環境中，Arecoline 會快速水解成 Arecaidine，由於 Arecoline 的量減少相對的消耗掉 Glutathione 的量也減少。故可以證實 Arecoline 與 Glutathione 之間交互作用 確實具有酸鹼依賴性。另外，從 Arecoline 與 Glutathione 在不同酸鹼值緩衝 溶液加成物的反應、純化及質譜分析分析結果中顯示至少有三種不同的加 成物在其交互作用之反應中形成，可以得知加成反應程序機轉是存在的(圖 28)，並且加成產物是可以被分離出來。
參 考 文 獻
1. Huang JF, Chen CC, Tsai CC. The effects of betel nut alkaloids on human oral fibroblasts. Chia-nan Annual Bulletin.1994;20:123-137.
2. Chang MC, Ho YS, Chan CP et al. Areca nut extract and arecoline induced the cell cycle arrest but not apoptosis of cultured oral KB epithelial cells:
association of Glutathione, reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Carcinogenesis.2001; 22(9):1527-1535.
3. Chang BE, Liao MH, Kuo YP, Chen CH. Developmental Toxicity of Arecoline, the Major Alkaloid in Betel Nuts, in Zebrafish Embryos. Birth
Defects Res A Clin Mol Teratol.2004;70:28-36.
4. Lai KC; Lee TC. Genetic damage in cultured human keratinocytes stressed by long-term exposure to areca nut extracts. Mutat Res.2006;599:66-75.
5. Dasgupta R, Saha I, Pal S et al. Immunosuppression, hepatotoxicity and depression of antioxidant status by arecoline in albino mice. Toxicology.2006;
227:94-104.
6. Lee PH, Chang MC, Chang WH et al. Prolonged exposure to arecoline arrested human KB epithelial cell growth: Regulatory mechanisms of cell cycle and apoptosis. Toxicology.2006; 220:81-89.
7. Cox S, Piatkov I, Vickers ER, Ma G. High-performance liquid chromatographic determination of arecoline in human saliva. J Chromatogr A.
2004; 1032:93-95.
8. Jeng JH, Tsai CI, Hang LJ et al. Arecoline Cytotoxicity on Human Oral Mucosal Fibroblasts Related to Cellular Thiol and Esterase Activities. Food
Chem Toxicol.1999; 37:751-756.
9. Chatterjee A, Deb S. Genotoxic effect of arecoline given either by the peritoneal or oral route in murine bone marrow cells and the influence of N-acetylcysteine. Cancer Lett.1999; 139:23-31.
10. Kyto V, Lapatto R, Sarate A et al. Glutathione depletion and cardiomyocyte apoptosis in viral myocarditis. Eur J Clin invest.2004; 34:167-175.
11. Kawakami SK, Gledhill M, Achterberg EP. Determination of phytochelatins and Glutathione in phytoplankton from natural waters using HPLC with fluorescence detection. Trends Analyt Chem.2006; 25:13-3142.
12. Michelet F, Gueguen R, Leroy P et al. Blood and Plasma Glutathione Measured in Healthy Subjects by HPLC. Clin Chem.1995; 41:1509-1517.
13. Fan Y, Schreiber EM, Giorgianni A, Yalowich JC, Day BW.
Myeloperoxidase-Catalyzed Metabolism of Etoposide to Its Quinone and Glutathione Adduct Forms in HL60 Cells. Chem res toxicol.2006;
19:937-943.
14. Yu LJ, Chen Y, Deninno MP, O’Connell TN, Hop CE. Identification of a novel Glutathione adduct of diclofenac, human liver microsomes.Drug
Metab Dispos.2005; 33:484-488.
15. Pauluhn J, Brown WE, Hext P, Leibold Edgar, Leng G. Analysis of biomarkers in rats and dogs exposed to polymeric methylenediphenyl disocyanate (pMIDI) and its glutathione adduct. Toxicology.
2006;222:202-212.
16. Kinoshita K, Ochi T, Toshihide S, Kita K, Kaise T. Glutathione plays a role in regulating the formation of toxic reactive intermediates form diphenylarsinic acid. Toxicology.2006;225:142-149.
17. Boyland E, Nery R. Mercapturic acid formation during the metabolism of Arecoline and Arecaidine in the rat. Biochem J.1969;113:123-130.
圖 1.檳榔生物鹼之結構式。
圖 2.Glutathione 之結構。
圖 3.Glutathione 之生合成路徑圖。
圖 4. Arecoline 和 Arecaidine HPLC 層析圖譜。
層析管： Puroshere RP-18(5μm), 250 x 4 mm (E-Merck)
移 動 相 ： 0.05M 磷 酸 緩 衝 溶 液 ( 內 含 有 5mM PIC B7), pH=5.0/Acetonitrile=85/15
流速：1 ml/min
內部標準品：Imidazole 檢測器波長：UV 215 nm
圖 5.Arecoline 標準溶液檢量線圖。
圖 6.Arecaidine 標準溶液檢量線圖。
圖 7.Glutathione 標準溶液檢量線圖。
圖 8.Arecoline 與 Glutathione 在 不 同 pH 值 之 間 的 交 互 作 用 中 Arecaidine/Arecoline 含量統計圖。
等濃度(5.0μmol/ml)之 Arecoline 和 Glutathione 在 37℃中反應 20 分鐘後利 用 HPLC 檢測 Arecolone 與 Arecaidine 的含量。
Bars are the means of triplicate determinations:
* Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.05.
** Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.01.
*** Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.0001.
圖9. Arecoline 與 Glutathione 在不同 pH 值之間的交互作用 Glutathione 含量 統計圖。
等濃度(5.0µmol/ml)之 Arecoline 和 Glutathione 在 37℃中反應 20 分鐘後利用 螢光光度計檢測Glutathione 的含量。
Bars are the means of triplicate determinations:
* Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.05.
** Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.01.
*** Statistically significant, as compared to initial concentration, p<0.0001.
A.
圖 10. pH=8.0(A)和 pH=12.0(B)緩衝溶液中，Arecoline 與 Arecaidine 反應之 動力曲線圖。
Arecoline 分別在 pH=8.0 和 pH=12.0 緩衝溶液不含 Glutathione，於 37℃水 浴鍋中反應60 分鐘後利用 HPLC 檢測 Arecolone 與 Arecaidine 的含量。
A.
圖 11. pH=8.0(A)和 pH=12.0(B)緩衝溶液中，Arecoline 和 Glutathione 交互作 用之動力反應曲線圖。
於37℃水浴鍋中反應 60 分鐘後利用 HPLC 檢測 Arecolone 與 Arecaidine 的含 量。
圖 12. Arecoline 與 Glutathione 在 pH=8.0 緩衝溶液中之動力反應曲線圖。
Adduct
Adduct
圖 14. Arecoline 與 Glutathione 在 pH=10.0 緩衝溶液中，加成物滯留時間在 4.55 分鐘之 HPLC 層析圖譜。
Adduct
圖 15. Arecoline 與 Glutathione 在 pH=12.0 緩衝溶液中，加成物滯留時間在 7.90 分鐘之 HPLC 層析圖譜。
圖 16. pH=8 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 檢測的層析圖譜。
層析管：LC-CN (3 um), 150 x 2.1 mm (SUPELOSILTM) 溫 度：20℃
移動相：1% HCOOH 注射量：10ul
流 速：0.1ml/min 時 間：25 min
圖 17. 在 pH=8.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，在 14.07 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 18.在 pH=8.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測在 17.52 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 19. 在 pH=8.0 MS/MS 分析加成物 463m/z[Adduct]+質量□片圖。
圖 20. pH=12.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 檢測的層析圖譜。
層析管：LC-CN(3 um), 150 x 2.1 mm (SUPELOSILTM) 溫 度：20℃
移動相：1% HCOOH 注射量：10 ul
流 速：0.1 ml/min 時 間：25 min
圖 21.在 pH=12.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，在 12.57 至 14.70 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 22. 在 pH=12.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，在 16.55 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 23. 在 pH=12.0 MS/MS 分析加成物 449m/z[Adduct]+質量□片圖。
圖 24. pH=10.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 檢測的層析圖譜。
層析管：LC-CN (3 um), 150 x 2.1 mm (SUPELOSILTM) 溫 度：20℃
移動相：1% HCOOH 注射量：10 ul
流 速：0.1 ml/min 時 間：25 min
圖 25.在 pH=10.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，在 13.97 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 26.在 pH=10.0 緩衝溶液中進行交互作用反應時所產生的加成物，經由 LC/MS 的檢測，在 17.67 分鐘波峰其質量□片圖。
圖 27. 在 pH=10.0 MS/MS 分析加成物 420m/z[Adduct]+質量□片圖。
圖 28. Arecoline 與 Glutathione 加成反應可能的路徑。