橢偏儀檢測表面薄膜

在量測生化樣本之前，以重複性的測試來確定系統穩定性。採用4 英吋的<100>晶格方 向之矽晶圓（silicon wafer）做為測試載具，紀錄其橢偏參數ψ 與∆ 值對馬達紀錄讀數的變 化，馬達紀錄讀數由0 至 64000，則橢偏參數之變化圖如圖 4.22（a）所示，其中顯示橢偏 參數ψ 在小角度（即馬達讀數小於 15000）入射時會有較大的誤差值，大約 3°左右，而在 更小的角度（馬達讀數約小於3000）入射時，其ψ 值有非常大的變動，表示光源在此小角 度入射後，其反射光無法延原光路返回，導致光偵測器無法接收到反射光之光強值，因而 使得訊號雜亂；在大角度（馬達讀數大於 60000）時亦是如此，而ψ 值在其他的角度則有 較高的重複性。另外對於橢偏參數∆ 而言，馬達讀數在 3000 以下與 60000 以上有較大的雜 訊，與馬達讀數在50000 與 60000 之間有最大近 10°之誤差值以外，其他區域之誤差範圍約 為4°。由此重複性實驗中可知，橢偏參數ψ 在馬達讀數15000 至 60000 之間有較佳之重複 性，而橢偏參數∆ 較佳的重複性則是在馬達讀數 3000 至 50000 之間。故在往後實驗中可取 馬達讀數15000 至 50000 這段範圍做為參考依據。

圖4.22 (a) 系統重複性測試：橢偏參數ψ 對馬達紀錄讀數之變化

圖4.22 (b) 系統重複性測試：橢偏參數 ∆ 對馬達紀錄讀數之變化

本系統開發的主要目的是為了應用於生物鍵結反應量測，故本研究接下來利用橢圓偏 光術量測相關之生化反應，以下先說明觀察ELISA 微陣列下的生醫反應結果。

在生醫反醫實驗中，為了於晶片表面固定生物分子，增加生物分子的吸附量及均勻性，

整體的實驗步驟如下：

步驟一：以PBS 溶液做為緩衝液，40µl，沖洗表面並量測橢偏參數；

步驟二：加入濃度20mM 的生物連結物(HS-(CH2)7COOH)，40µl，停留時間 600 秒；

步驟三：以PBS 溶液做為緩衝液，40µl，沖洗表面並量測橢偏參數；

步驟四：加入EDC/NHS 體積 40µl，使生物連結物活化(activation)，停留時間 420 秒；

步驟五：以PBS 溶液做為緩衝液，40µl，沖洗表面；

步驟六：加入人類免疫球蛋白(Human IgG，400µg/ml)，40 µl，停留時間 420 秒；

步驟七：以緩衝液PBS 清洗，40µl，帶走未固定之人類免疫球蛋白抗體，沖洗表面並 量測橢偏參數；

步驟八：添加EA，體積 40µl，填充未連結的空缺晶片表面，停留時間 300 秒；

步驟九：以緩衝液清洗，體積40µl，帶走未固定之 EA 填充物，停留 420 秒；

步驟十：加入人類抗原免疫球蛋白(Anti-IgG，100µg/ml)，體積 40µl ，停留 900 秒；

步驟十一：以緩衝液清洗，體積40µl，帶走未固定之人類抗原免疫球蛋白，沖洗表面 並量測橢偏參數。

（a）Au （b）Au+linker

（c）Au+linker+IgG （d）Au+linker+IgG+Anti-IgG 圖4.23 ELISA 重複性實驗

以同樣條件與樣本的環境之下，重複做三次實驗，觀察其結果之重複性。由圖4.23（ａ）

～（ｄ）之重複性圖形可得知，在未加入人類免疫球蛋白（IgG）之前，其重複性相當之高，

誤差範圍在3°之內，但在加入人類免疫球蛋白（IgG）之後，如圖 4.23（ｃ）（ｄ）所示，

其反應有不一樣之變化產生，在圖4.23（ｃ）中完全無重複性可言，其原因是量測到生物 試樣吹乾後所生成的一些鹽類殘留物，而導致在量測時有極大的誤差產生，而且所產生的 雜訊相當的大，再得知所量測之結果有誤差產生後，便將量測區域的位置移動至較好之區 域，再加以量測人類抗原免疫球蛋白（Anti-IgG），因此由圖 4.23（d）中可知只有一次實驗 之結果重複性較差以外，其他兩次的重複性亦是相當的高。若是在量測中能避開量測到生 物試樣所殘留之鹽類，則可量測到較佳之結果。以下便取較好的一次結果對ELISA 試驗之 結果進行分析與討論。

圖4.24(a) 橢圓偏光術於生物薄膜固定化技術：橢偏參數ψ 對入射角度之變化

圖4.24(b) 橢圓偏光術於生物薄膜固定化技術：橢偏參數∆ 對入射角度之變化

由圖4.24 之 ELISA 實驗結果所示，以橢偏術來量測生物分子之鍵結反應，其橢偏參數 ψ 值在每一個步驟反應後其變化並無太大的改變，而橢偏參數∆ 值，則是有較明顯且規則 的變化，因此由此結果可推斷再每加入一反應物之後，其厚度是有改變的，證實生物鍵結

反應的發生與存在。而其誤差之主要來源為在做ELISA 反應的每個步驟，皆需將試片上之 試樣吹乾後，再加以量測，以提升整體反射光強與訊雜比，亦可固定入射角度不會因而改 變，但卻導致生物試樣並非在於緩衝劑中量測，無法確保生物試樣的型態。另外由於將生 物試樣吹乾後會生成一些鹽類殘留物，而導致在量測時有極大的誤差產生。