波導干涉儀檢測生物分子：ELISA 生醫鍵結反應量測

確定了系統的精確度後，就開始進行生物鍵結反應實驗的實驗，本實驗為使用 ELISA 方式觀察生物反應量測，每隔固定的時間擷取訊號，生物樣本則選用在實驗量測製造技術 純熟的人類免疫球蛋白(Human IgG)和人類抗原免疫球蛋白(Human Anti-IgG)，但要確定抗 原均勻的覆蓋在晶片表面上必須加入生物架接層(linker)，以下將先說明活化波導晶片和生 物架階層的製備步驟。

z 波導晶片活化及生物架接層製備步驟

進行生物架階層的製備步驟所需的溶液為 PBS(phosphate buffer saline PH=7.2)、硝酸 (HNO3)、5%的酒精水溶液、3-APTES(5%的 3-aminopropyltriethoxysilance 溶於 5%的酒精)、

戊二醛(2.5%的 Glutaraldehyde 溶於 PBS)， 以下為活化波導晶片及生物架接層製備步驟。

步 驟 一 ：表 面 活 化。 將 波 導 晶 片 浸 泡 於 濃 硝 酸 20 分 鐘 活 化 表 面 的 silanol group(Si-OH)，反應完後再浸泡於 5%的酒精水溶液清洗 10 分鐘。

步驟二：加入生物架接層進行矽烷化處理。將活化後的波導晶片浸泡於3-APTES 內反應 30 分鐘，使晶片表面產生共價鍵結的官能基，如-NH2，反應完後再浸泡於5%的酒精 水溶液清洗10 分鐘。

步驟三：活化生物架接層。將晶片浸泡於戊二醛60 分鐘，使其一端與基材產生共價鍵結，

令一端能和生物分子架接，反應完後再浸泡於5%的酒精水溶液清洗 10 分鐘。

z 生物樣本製備步驟

完成上述的步驟後就能確保波導晶片能鍵結抗原，因晶片上架接層的-CHO 端會和抗原 的-NH2端產生共價鍵結，使抗原固定。接下來就可開始進行生化反應的 ELISA 量測實驗，

整體的實驗步驟如下所示：

步驟一：以PBS 溶液做為緩衝液，100µl，沖洗表面並量測其相位值，作為實驗基準相位值。

步驟二：加入人類抗原免疫球蛋白(Human Anti-IgG，100µg/ml)，50µl，停留時間為 300 秒，

並量測其相位值。

步驟三：加入PBS 溶液，100µl，帶走未固定之人類抗原免疫球蛋白，沖洗表面並量測其相 位值。

步驟四：加入1M Ethanolamine-HCL，100µl，填充未聯結的空缺晶片表面，停留時間 900 秒，並量測其相位值。

步驟五：加入PBS 溶液，100µl，帶走未固定之 Ethanolamine-HCL，沖洗表面並量測其相 位值。

步驟六：加入人類免疫球蛋白(Human IgG1，50µg/ml)，50µl，停留時間為 900 秒，並量測 其相位值。

步驟七：加入PBS 溶液，100µl，帶走未固定之人類免疫球蛋白，沖洗表面並量測其相位值。 PBS PBS PBS

TE偏極態ELISA生醫反應

圖 4.26 TM 偏極態之 ELISA 架構生醫鍵結反應

PBS 1.3342 0.073 0.1453 1.3352 9 3.57E-8 Anti-IgG - 2.911 2.345 1.3472 17 6.56E-8

圖 4.27 反算生化反應各層折射率和厚度圖

由上圖可發現折射率隨著不同的生物樣本流入而有上下起伏的現象，厚度值則隨著樣 本流入而增加，不過反算的結果仍和理論的變化現象有些許出入，研判會有誤差的可能原 因為，進行TE 和 TM 量測實驗並非於同一時間取訊號，所以外界雜訊造成的誤差可能不 同。此外，利用ELISA 的量測方式可能會因為 PBS 未將前一次樣本完全清洗乾淨，使量測 值產生誤差，造成反算結果有誤。不過由此反算程式還是可使本系統量測之光學訊號轉換 為生物參數資訊，且雙偏極光的量測方式可將生物參數資訊細分為折射率和厚度項，對於 判斷複雜的生化反應現象有極大的幫助。

z 重現性量測結果

ELISA 最後一個實驗為重現性的量測，此量測方式為固定 Anti-IgG 的濃度，改變 IgG 的濃度進行一連串的訊號量測，選用的量測光為 TE 偏極態，選定的 Anti-IgG 濃度為 100µg/ml，IgG 濃度則為 50µg/ml、100µg/ml、200µg/ml、500µg/ml，再流過下一個濃度的 IgG 會先使用 Glycine 破壞 Anti-IgG 與 IgG 之鍵結，讓之後的 IgG 鍵結，實驗結果如圖所 示。由實驗結果圖可見，流入各生物樣本訊號接有改變的現象，且流過Glycine 訊號也的確 有因解離效果造成訊號降低，但理論上IgG 濃度越高，鍵結力應越強，訊號應越高，但實 驗並無看出此現象，研判可能原因為IgG 使用的濃度已過高，造成飽和的現象，故不管流 入何種樣本訊號皆無法跟濃度呈正比上升。

圖4.28 TE 偏極態之 ELISA 架構生醫鍵結再生實驗