前言

近年來國內糖尿病患者激增，台灣衛生署報告顯示糖尿病為歷年 十大死亡原因之一，且罹病的年齡層逐漸下降，所以血糖偵測器為一 重要之研究主題。目前的血糖測試儀多半使用酵素感測電極，由於酵 素反映有訊號放大的效果，再加上酵素本身對基質的高選擇性，使得 酵素在生物感測器的研發上扮演著重要的角色，可以達到方便、快速 與精準的測試結果。將葡萄糖氧化酵素 (Glucose oxidase, GOx) 固定 於修飾電極上，可形成強有力的分析儀器，用以偵測患糖尿病人之血 糖即為最典型的例子。

於製作葡萄糖酵素電極的重要因素之一為電極的材質，電極的材 質關係到酵素的固定化、電流傳導及電極的製作成本等。目前使用於 製作葡萄糖酵素電極的電極材質，主要分金屬 (含金屬氧化物) 及非 金屬的碳兩大類。本實驗將樹狀金與經過還原過的氧化石墨烯形成複 合式材料電極，再將葡萄糖氧化酶固定在電極上完成葡萄糖酵素電 極。

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3.2 葡萄糖氧化酶簡介

蛋白質能發揮多種多樣的功能，其中催化作用(Catalysis)是重要的 功用之一，若催化作用不存在，生物系統內的反應就會進行太慢而無 法以適當的速度供應產物給代謝中的生物體。在生物體中執行此功能 的催化劑被稱為酵素(Enzyme，即酶)，生物體內所有酵素皆是蛋白質。

目前酵素是已知最有效的催化劑。此外，酵素具有高特異性，可區分 一個化合物的立體異構物，在很多情形中，酵素的催化作用是藉由控 制程序精細地被調整。

葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOx)能專一地將 β-D(+)-葡萄糖 氧化成葡萄糖酸並產生過氧化氫。⁵⁹ 由於 GOx 能夠利用氧氣將葡萄 糖氧化成葡萄糖酸而有效去除氧，因而被廣泛用作抗氧化劑、葡萄糖 酸、糖尿試紙和生物感測器的發展，其產品應用於醫藥領域、食品加 工業、飼料行業和科學研究等各方面。

葡萄糖氧化酶是由 Muller 於 1928 年首先從黑麴黴（Aspergillus niger）的萃取液中發現。1960 年 Kusai 等人、1964、1965 年 Pazur、

Swobodda 等人分别從青黴素黴和黑麴黴纯化葡萄糖氧化酶。⁶⁰

葡萄糖氧化酶屬於雙體蛋白質，其中每一個單體含有一個 Flavin- adenine dinucleotide (FAD)作為其輔酶(Cofactor)。是生物活性的來源，

因此失去輔酶 FAD 的葡萄糖氧化酶也就喪失了催化活性。⁶¹

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3.3 葡萄糖生物感測機制

葡萄糖氧化酶能在具有氧氣的條件下，將 β-D-glucose 催化成為 葡萄糖酸內酯(gluconolactone)再水解成葡萄糖酸(gluconic acid)，且具 有高度專一性，同時生成副產物過氧化氫（H2O2），其間會消耗掉氧 分子作為電子的接受者（electron acceptor），⁶²反應如圖 3-1 所示。

圖 3- 1 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反應方程式

在此反應中葡萄糖是我們欲偵測的分子，且為葡萄糖氧化酵素的基質。

為了知道液體中有多少葡萄糖，我們可以測量反應溶液中氧氣的消耗 量，此數據可以決定酵素的催化反應是否正在進行，以及進行的速度。

利用酵素的自然反應完成偵測屬於第一代葡萄糖生物感測器的設計，

必需利用氧電極或過氧化氫電極配合葡萄糖氧化酶量測，然而此反應 機制必須依賴溶液中溶氧濃度，為了克服此問題，研發了以非生理物 質之”電子傳遞媒介物”幫助酵素當作電子提供或接受者，即為第二代 葡萄糖生物感測器的設計概念，其反應機制如下: ⁶³

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Enzyme Mediator Redox potential (vs.SCE)/mV Glucose oxidase 1,1-dimethyl ferrocene

Ferrocene Vinyl ferrocene Ferrocene carboxylic acid Hydroxy methyl ferrocene

[Ru(CN6)]

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4. 若還原態的 Mediator 氧化反應無氫質子的參與，則酵素電極較不 受系統 pH 的影響。

3.4 結果與討論

3.4.1 氧化石墨烯之電化學還原(rGO)

本研究利用電化學循環伏安法 ^66，67 還原修飾在樹狀金電極(GD) 的氧化石墨烯(GO)，所使用的儀器是 CH Instrument model 614B series electrochemical analyzer。圖 3-2 為 GO/GD 電極在磷酸緩衝溶液中 (pH5.0)電位範圍從 0 到-1.5 V 之還原 CV 圖。過程中，第一圈即可看 到明顯的還原峰在電位-1.25 V，這是表面 GO 的氧官能基團，⁶⁸例如 羥基(C-OH)、還氧基(C=O)、羰基(C-O)和羧基(COOH)等鍵結的還原。

圖 3- 2 GD/GO 電極在 PBS 緩衝液(pH 5.0)電化學還原 CV 圖，掃描 速率=50 mV/s。

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3.4.2 還原態氧化石墨烯-樹狀金複合材料(GD/rGO)結構鑑定 3.4.2.1 SEM 分析

本研究以 XPS、Raman、SEM 和 EDS 分析研究，鑑定其結構與 表面型態，首先以 SEM 研究分析，觀察 GD/rGO 複合材料表面之型 態。如圖 3-3 (a)為樹狀金以及(b)還原後的氧化石墨烯覆蓋修飾在樹狀 金電極上之比較圖。從圖中可清楚看到經電化學還原後的氧化石墨烯 在樹狀金上呈現透明皺褶狀，與單獨樹狀金的表面型態比起來相差甚 多；當氧化石墨烯表面官能基進行還原後，使結構中的 sp²變多，可 使導電率(Conductivity)提高，修飾在樹狀金上可以再增加電極整體導 電率。

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圖 3- 3 SEM (a)樹狀金電極(GD), (b) GD/rGO 複合材料。

3.4.2.2 XPS 分析

本 論 文 以 XPS 做 結 構 鑑 定 ， 所 使 用 的 儀 器 是 PHOIBOS Hemispherical Energy Analyzer；藉由 XPS 圖譜來佐證氧化石墨烯(GO) 在樹狀金上還原成石墨烯(rGO)。本論文以 Mg K_α X-ray 之光源，其 能量為 1253.6 eV。

圖 3-4 為樹狀金電沉積在玻璃碳電極 XPS 圖譜，圖 3-4(d)樹狀金 佔據電極表面，金訊號強度甚強，而圖 3-4 (b)氧(~532 eV)及圖 3-4 (c)

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碳(~284.8 eV)訊號極弱，來自於玻璃碳電極及樹狀金表面些許氧化 物。

圖 3- 4 (a)樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧 O1s訊號峰，(c)碳 C1s訊號峰，

(d)金 Au

圖 3-5 為氧化石墨烯修飾於樹狀金電極 XPS 圖譜，與上圖 3-4 做 比較；由圖 3-5 (b)可知氧訊號峰強度極高，電極表面含有大量氧分子，

此大量氧官能基團在表面有絕緣作用，使氧訊號位移至~533 eV，圖 4-4 (c)碳之訊號峰分裂為兩根，此為碳-氧官能基的鍵結造成且訊號強 度提高並位移至~286.5 eV，證實來自於電極表面之氧化石墨烯⁶⁹。圖 3-5 (d)為來自樹狀金電極之金訊號峰。

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圖 3- 5

(a)氧化石墨烯修飾於樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧 O

(c)碳 C

圖 3- 6

(a)GD/rGO 複合材料 XPS 圖譜，(b)氧 O

訊號峰，(d)金 Au4f訊號峰。

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經過電化學循環伏安法還原氧化石墨烯後得圖 3-6 (a) XPS 圖譜，

與上圖 3-5 做比較，圖 3-6 (b)氧訊號峰(~532.3 eV)降弱，圖 3-6 (c)碳 訊號峰(~284.7 eV)不再開裂為兩峰且半高寬變窄。證實石墨化程度提 高，已將原本氧之官能基團多數還原。

3.4.2.3 Raman 分析

本論文使用的儀器是 Uni Ram system，利用波長 532 nm 雷射光，

並使用顯微聚焦系統，光斑大小為 1 µm，其輸出功率為 20 mW/cm²。 我們利用拉曼散射光譜分析經過電化學還原的 GD/rGO 複合材料，藉 由參考文獻得知，石墨烯的拉曼光譜在約 1580 cm^-1會有一根稱為 G band 的特徵峰，其振動模式為六方單晶中二維平面碳原子 sp²之間的 偶合，而氧化石墨烯的拉曼光譜在約 1350 cm^-1 會看到一根稱為 D band 的特徵峰，為石墨結構中的缺陷與 sp³鍵所導致的震動模式，值 得注意的是 D band 與 G band 的強度比值，如圖 3-7 (a)所示，G band 強度比 D band 些許高出，反之，電化學還原得到的 GD/rGO 圖 3-7 (b) 則 D band 強度高於 G band，這是由於還原後 rGO 的缺陷程度遠大於 GO。此外，rGO 的 G band 位置相較於 GO(1606 cm^-1)，紅移至 1595 cm^-1， 表示經過還原後碳原子更接近石墨烯的六方網狀結構。⁵⁰

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圖 3- 7 (a) GD/ GO 複合材料，(b)電化學還原之 GD/rGO 複合材料拉 曼散射光譜

3.4.3 GD/rGO/GOx 修飾電極的電化學阻抗分析

本研究透過電化學阻抗(EIS)探討各種不同葡萄糖氧化酶修飾電 極的導電性，所使用的儀器是 CH Instrument model 614B series electrochemical analyzer。以 0.1 M KCl 配置 5mM Fe(CN)6

3-/Fe(CN)6

4-電解液，利用三電極系統量測此電化學阻抗，在玻璃碳電極的表面上 修飾不同的薄膜，電極表面的電雙層電容以及電子轉移速率也會有所 不同，應用電極反應過程和介面型態去做檢測。圖 3-8 分別為玻璃碳

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電極(GCE)、玻璃碳-葡萄糖氧化酶(GCE/GOx)、樹狀金電極(GD)、樹 狀金-葡萄糖氧化酶(GD/GOx)、樹狀金-石墨烯(GD/rGO)、樹狀金-石 墨烯-葡萄糖氧化酶(GD/rGO/GOx)，圖中可以明顯看出不同的修飾電 極具有不同大小的直徑半圓，表示這些修飾電極有不同的導電性，而 電極表面含有 GOx 時皆呈現較大直徑的半圓，代表修飾 GOx 後的電 阻抗明顯增加而導電性降低，因為蛋白質高分子的氧官能基團會在電 極介面上形成電子傳遞之絕緣層，因此降低了電解液與電極介面處的 電子傳遞。⁷⁰此外，由圖中也得知樹狀金電極的阻抗遠小於玻璃碳電 極，金的樹枝型態使表面積大幅增加因此導電性極好，再者，修飾 rGO 之後因為石墨烯本身獨特的導電性質更進一步幫助電極進行電子轉 移的能力。

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圖 3- 8 葡萄糖氧化酶修飾在各不同電極之電化學阻抗圖譜，以 0.1 M

KCl 配置 5 mM Fe(CN)

3-/Fe(CN)

插圖為 GD/rGO 電極與 GD/rGO/GOx 電極

3.4.4 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極對 pH 值及掃描速率之 研究

GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在 PBS 中進行電化學伏安掃描會 看到一對 GOx 的氧化還原對(FAD/FADH2)，我們觀察不同 pH 值對 GOx 氧化還原對的影響，圖 3-9 為 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極，

在已除氧不同 pH 值範圍 1 到 11 的 PBS 中 CV 圖，由圖可觀察 GOx

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不受 pH 影響，在範圍中皆有明顯的氧化還原對，可推測此修飾電極 獲得一個好的再現性；進一步的看到(FAD/FADH2)氧化還原對波峰(E^o) 值會穩定地隨著 pH 值增加而往負電位移動，且反應電流也有增大的 趨勢，插圖為 pH 值 vs.形式電位(E^o)檢量線，形式電位和 pH 呈現良 好的線性關係，得到斜率為 53.1 mV/pH，此結果接近其他已發表的 文 獻 ， 且 相 當 接 近 於 能 斯 特 方 程 式 (Nernst equation) 理 論 值 -59.2 mV/pH，能斯特方程式如下:

Oxidation + n e⁻+ m H⁺ ↔ Reduction (3 − 4) 在溫度為 25℃時

E = E⁰−0.0592

n log [Reduction]

[Oxidation][H⁺]^m (3 − 5) E = E⁰− 0.0592 (m

n) log 1

[H⁺] (3 − 6) E = E⁰− 0.0592 (m

n) pH (3 − 7) 其中，n 為反應中參與的電子數；m 為質子數目，因此由方程式可得 知 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極質子與電子轉移比例幾乎相等。

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圖 3- 9

GCE/GD/rGO/GOx/Nf 電極在已除氧不同 pH 值的 PBS 中(pH 1-11)測得電化學 CV 圖，掃描速率=50 mV/s；插圖為 pH vs.E

圖 3-10 顯示 GD/rGO/GOx/Nf 電極在已除氧的 PBS 中不同掃描速 率的循環伏安圖，掃描速率從 10 mV/s 到 1000 mV/s，插圖為I_pa和I_pc與 掃描速率之檢量線，氧化還原電流與速率成呈現線性關係，表示此修 飾電極為薄膜表面直接電子轉移行為(Surface electron transfer)，此外，

我們可以利用此線性回歸計算出 GOx 電化學表面覆蓋濃度(Γ)由 Laviron’s equation: ⁷¹

I_p =n²F²vAΓ

4RT (3 − 8)

其中，n為每一反應物分子的電子數(n=2)、 F=96485 為法拉第常數、

I_p=1.0× 10⁻⁴ A為電流值、v=0.1 V/s 為掃描速率、A=0.07 cm²為電極 表面積，氣體常數R=8.314 JK^-1mol^-1，T=298 K，經計算得到 GOx 表

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面覆蓋濃度Γ= 3.81×10^-9 mol·cm^-2。

而 GCE/GD/rGO/GOx/Nf 的葡萄糖氧化酶電子轉移速率常數(k_𝑠) 也可由Laviron’s equation^72，73計算得知，套用下列公式:

log𝑘_𝑠 = α log(1 − α) + (1 − α)logα − log (RT nFv)

−α(1 − α)nF∆E_P

2.3RT (3 − 9) 其中α為電化學轉移係數~0.5 , ∆E_P=0.0275 V 為 FAD/FADH2氧化還 原對波峰電位差(∆E_P = |E_p − E⁰|)，v=0.1 V/s；經計算k_s值為 2.28 s^-1， 此數值高於其他文獻紀載中之k_s值。

圖 3- 10 (a) GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在 PBS (pH 7)中不同掃描 速率之 CV 圖，從 0.01 V/s 到 1 V/s，掃描範圍從 0 到 0.8 V，(b)掃描

速率對反應電流之檢量線。