樹狀奈米金與rGO複合材料合成與其電化學感測之研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文. 樹狀奈米金與rGO複合材料合成與其電化學感測之研究. Synthesis of Gold Nanodendrites-Reduced Graphene Oxide Composite Materials for Electrochemical Analysis. 指導教授:洪偉修博士研究生:劉侑昂中華民國一百零三年六月.

(2) 摘要本研究利用葡萄糖氧化酶(GOx)和血紅蛋白(Hb)兩種酵素分別偵測葡萄糖與過氧化氫，本實驗製作了還原態氧化石墨烯(rGO)與樹狀金電極(GD)的複合材料(GD/rGO)並搭配酵素的薄膜修飾進而製備高靈敏度之生物感測器。應用循環伏安技術和計時電流安培法研究此電極電化學特性。由電化學阻抗(EIS)分析酵素已成功修飾，在 X 射線光電子能譜(XPS)及拉曼散射光譜的鑑定下證實氧化石墨烯已完成電化學法還原並與樹狀金電極形成複合材料。並利用掃描電子顯微鏡觀察薄膜的表面型態。且根據電化學實驗計算出酵素與修飾薄膜電極表面具快速的電子轉移能力。從計時安培法結果顯示此 GD/rGO/GOx/Nf(Nafion)薄膜對於葡萄糖偵測展現出<3 s 的電流響應時間，並具有 0.008 mM 到 7.2 mM 寬廣的偵測線性範圍、5 µM 最小偵測極限和良好的靈敏度 25.23 µAmM-1cm-2。另一方面，GD/rGO/Hb/Nf 薄膜偵測過氧化氫也有<5 s 的電流響應時間，寬廣的線性範圍 0.003 mM 到 22.7 mM、與極低的偵測極限 1 µM 和 0.623 mAmM-1cm-2 的靈敏度。 GOx 薄膜修飾電極在含有電子傳導媒介偵測葡萄糖時展現出好的電催化活性，而 Hb 對於偵測過氧化氫也有卓越的電催化還原能力，並且在製備過程中具備簡易、有效率及無環境污染等優點。 I.

(3) 關鍵字:電化學還原氧化石墨烯，樹狀金電極，血紅蛋白，葡萄糖氧化酶，生物感測器. II.

(4) Abstract In this thesis, we report the fabrication two highly sensitive hydrogen peroxide and glucose biosensor based on immobilization of glucose oxidase (GOx) and hemoglobin (Hb) on the composites of graphene oxide (rGO) gold dendrites (GD), which are electrodeposited on the GC electrode (GCE). The electrochemical characteristics of the biosensor were studied by cyclic voltammetry (CV) and amperometry. The modified process was characterized by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic votammetry. The morphologies of modified film were investigated with scanning electron microscopy (SEM) and the element of film was investigated with X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and Raman spectroscopy. GOx and Hb were well immobilized onto the GD/rGO film on the rGO and GD composites. The experimental data demonstrate faster electron transfer between enzymes and the modified electrode surface. The. results. of. amperometry. response. indicates. that. GD/rGO/GOx/Nf(Nafion) film displayed a fast response of less than 3 s and exhibits low detection limit of 5 µM with wide linear range of 0.008-7.2 mM and good sensitivity of 25.23 µAmM-1cm-2 for glucose detection. On the other hand, the GD/rGO/Hb/Nf film also displays a response of less than 5 s. The proposed hydrogen peroxide biosensor shows a low detection limit of 1 µM with linear range of 0.003-22.7 mM and exhibits excellent sensitivity of 0.623 mAmM-1cm-2. The modified films show high electrocatalytic activity towards glucose in the presence of mediator and exhibit a remarkable III.

(5) electrocatalytic activity for the reduction of hydrogen peroxide. Moreover the fabrication of these two biosensors was simple, efficient and green technique.. Keyword: electrochemically reduced graphene oxide, gold dendrite, hemoglobin, glucose oxidase, biosensor. IV.

(6) 謝誌師大兩年碩士生涯終於走到的最後一站了，本論文可以順利完成最重要感謝的人是我的指導教授洪偉修博士，不管是實驗還是學業上的指導亦或是人生的啟發都幫助我不少，由於他的辛勤指導和教誨，讓我在研究的過程中受益良多，也感謝本校王禎翰老師和東海大學賴英煌教授等口試委員於百忙之中蒞臨指導。此外，感謝實驗室的學長姐們，誌濠學長在我碩一的時候耐心地教導我儀器的操作以及專業知識，也在生活中帶我們許多歡樂；感謝俞鈞、羽軒、庭瑜、星榮學長姊們的關心與照顧也幫助我在學業上的問題；一起奮戰兩年的智文、欣庭、云靜以及輔大的朋友們柏翔、競太、學瑋、冠中、鈺雅，謝謝你們在實驗上與生活上的關心和幫助，想到大家一起努力不懈的奮鬥就讓我覺得自己並不孤單；也謝謝王禎翰老師實驗室和化學系各實驗室的同仁們平日互相的幫忙。最後謝謝我的好朋友們與親愛的家人，由於你們的支持與鼓勵才能讓我順利地走過碩士班的日子，謝謝你們陪我一起完成這個人生重要的里程之一，我愛你們。. V.

(7) 目錄摘要................................................................................................................................ I Abstract ........................................................................................................................ III 謝誌............................................................................................................................... V 目錄..............................................................................................................................VI 圖目錄....................................................................................................................... VIII 表目錄..........................................................................................................................XI 第一章緒論.................................................................................................................. 1 1.1 感測器介紹...................................................................................................... 1 1.2 化學感測器...................................................................................................... 3 1.3 生物感測器...................................................................................................... 6 1.4 電化學生物感測器技術.................................................................................. 7 1.5 電化學分析法.................................................................................................. 9 1.6 化學修飾電極................................................................................................ 10 1.7 石墨烯............................................................................................................ 11 1.8 氧化石墨烯與還原態氧化石墨烯................................................................ 13 1.9 脈衝式電流電化學沉積法............................................................................ 16 1.10 三維樹狀金電極.......................................................................................... 17 第二章儀器與實驗藥品............................................................................................ 19 2.1 儀器介紹........................................................................................................ 19 2.1.1 X-ray 光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS） ... 19 2.1.2 循環伏安法(Cyclic Voltammetry, CV) .............................................. 23 2.1.3 電化學交流阻抗(electrochemical impedance spectroscopy, EIS) .... 25 2.1.4 安培法(Amperometric, i-t curve) ....................................................... 27 2.1.5 拉曼光譜(Raman spectrum) ............................................................... 28 2.1.6 掃瞄式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM) .............. 32 2.1.7 能量散射光譜儀(Energy Dispersive System, EDS) .......................... 34 2.2 實驗藥品........................................................................................................ 36 2.3 實驗步驟........................................................................................................ 37 第三章葡萄糖生物感測器........................................................................................ 39 3.1 前言............................................................................................................... 39 3.2 葡萄糖氧化酶簡介........................................................................................ 40 3.3 葡萄糖生物感測機制.................................................................................... 41 3.4 結果與討論.................................................................................................... 43 3.4.1 氧化石墨烯之電化學還原(rGO) ....................................................... 43 3.4.2 還原態氧化石墨烯-樹狀金複合材料(GD/rGO)結構鑑定............... 44 3.4.3 GD/rGO/GOx 修飾電極的電化學阻抗分析 ..................................... 49 VI.

(8) 3.4.4 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極對 pH 值及掃描速率之研究 ........ 51 3.4.5 薄膜修飾電極利用氧氣消耗以電化學循環伏安法偵測葡萄糖..... 55 3.4.6 薄膜修飾電極利用電子傳導媒介(Mediator)以電化學循環伏安法偵測葡萄糖...................................................................................................... 56 3.4.7 薄膜修飾電極以計時安培法偵測葡萄糖......................................... 59 第四章血紅蛋白酵素電極偵測過氧化氫................................................................ 64 4.1 前言................................................................................................................ 64 4.2 血紅蛋白介紹................................................................................................ 65 4.3 酵素催化還原過氧化氫................................................................................ 66 4.4 結果與討論.................................................................................................... 67 4.4.1 GD/rGO/Hb/Nf 薄膜修飾電極表面型態與元素分析 ...................... 67 4.4.2 GCE/GD/rGO/Hb 修飾電極的電化學阻抗分析 .............................. 69 4.4.3 GD/rGO/Hb/Nf 薄膜修飾電極對 pH 值及掃描速率之研究 ........... 70 4.4.4 薄膜修飾電極以電化學循環伏安法偵測過氧化氫......................... 73 4.4.5 薄膜修飾電極以計時安培法偵測葡萄糖......................................... 75 第五章結論................................................................................................................ 79 第六章參考文獻........................................................................................................ 80. VII.

(9) 圖目錄圖 1- 1 生物感測器組成基本元件示意圖 ............................................................... 7 圖 1- 2 石墨烯結構示意圖 ..................................................................................... 12 圖 1- 3(a) GO, (b) rGO 之 SEM 圖......................................................................... 15 圖 1- 4(a)石墨烯氧化物之化學結構，(b)還原後的分子模型 ............................. 15 圖 1- 5 脈衝式電流電化學沉積法參數示意圖 ..................................................... 17 圖 1- 6L-cystein 在樹狀金電極上之脫附 CV 圖 .................................................. 18 圖 1- 7 三維樹狀金電極成長機制 ......................................................................... 18 圖 2- 1 光電子的激發過程 ..................................................................................... 19 圖 2- 2 XPS 圖譜與原子能階 ................................................................................ 20 圖 2- 3 XPS 基本構造簡圖 .................................................................................... 21 圖 2- 4 半球形能量分析儀剖面圖(Hemspherical Energy Analyzer, HEA) .......... 22 圖 2- 5 (a)循環伏安法之波形，(b)循環伏安法 CV 圖 ........................................ 24 圖 2- 6 等效電路圖 ................................................................................................. 26 圖 2- 7 時間函數的電位波形 ................................................................................. 26 圖 2- 8 奈式圖(Nyquist plot)介紹 .......................................................................... 27 圖 2- 9 拉曼散射機制 ............................................................................................. 29 圖 2- 10 雷利及拉曼散射過程能階圖 ................................................................... 30 圖 2- 11 拉曼散射之振動模式示意圖 ................................................................... 31 圖 2- 12 SEM 基本構造示意圖.............................................................................. 32 圖 2- 13 SEM 入射電子產生之訊號...................................................................... 33 圖 2- 14 EDS 結合 SEM 基本構造示意圖 ............................................................ 34 圖 2- 15 EDS 原理示意圖 ...................................................................................... 35 圖 3- 1 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反應方程式 ..................................................... 41 圖 3- 2 GD/GO 電極在 PBS 緩衝液(pH5.0)電化學還原 CV 圖，掃描速率=50mV/s ................................................................................................................................. 43 圖 3- 3 SEM (a)樹狀金電極(GD), (b) GD/rGO 複合材料。 ................................ 45 圖 3- 4 (a)樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧訊號峰，(c)碳訊號峰，(d)金訊號峰 . 46 圖 3- 5 (a)氧化石墨烯修飾於樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧訊號峰，(c)碳訊號峰， (d)金訊號峰 ............................................................................................................ 47 圖 3- 6 (a)GD/rGO 複合材料 XPS 圖譜，(b)氧訊號峰，(c)碳訊號峰，(d)金訊號峰 ............................................................................................................................. 47 圖 3- 7 (a) GD/ GO 複合材料，(b)電化學還原之 GD/rGO 複合材料拉曼散射光譜 ............................................................................................................................. 49 圖 3- 8 葡萄糖氧化酶修飾在各不同電極之電化學阻抗圖譜，以 0.1 M KCl 配置 5 mM Fe(CN)63-/Fe(CN)64-電解液，頻率範圍 100 kHz~0.1 Hz。插圖為 GD/rGO 電極與 GD/rGO/GOx 電極 .................................................................................... 51 VIII.

(10) 圖 3- 9 GCE/GD/rGO/GOx/Nf 電極在已除氧不同 pH 值的 PBS 中(pH 1-11)測得電化學 CV 圖，掃描速率=50 mV/s；插圖為 pH vs.E0 ...................................... 53 圖 3- 10 (a) GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在 PBS (ph7)中不同掃描速率之 CV 圖，從 0.01 V/s 到 1 V/s，掃描範圍從 0 到 0.8 V，(b)掃描速率對反應電流之檢量線 ......................................................................................................................... 54 圖 3- 11 (a) GD/rGO/GOx/Nf, (b) GD/GOx/Nf, (c) rGO/GOx/Nf, (d)GOx/Nf 電極在含有飽和氧氣的 0.1 M PBS(pH7)中依序加入 0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、 3.0、4.0 mM 葡萄糖之 CV 圖，電位範圍 0.3 V 到-0.8 V，掃描速率 50 mV/s。 ................................................................................................................................. 56 圖 3- 12 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極利用 FMCA 當作電子傳導媒介偵測葡萄糖反應機制示意圖 ............................................................................................. 57 圖 3- 13 (a) GD/rGO/GOx/Nf, (b) GD/GOx/Nf, (c) rGO/GOx/Nf, (d) GOx/Nf 電極在含有 0.5 mM FMCA 的 0.1 M PBS (pH7)中依序加入 0.5、1、2、3、4、5 mM 葡萄糖之 CV 圖，電位範圍 0 V 到 0.7 V，掃描速率 50 mV/s ......................... 59 圖 3- 14 (a) GD/rGO/GOx/Nf, (b) GD/GOx/Nf, (c) rGO/GO/Nf, (d) GOx/Nf 薄膜修飾在旋轉電極上，在已除氧含有 0.5 mM FMCA 的 PBS(pH7)中利用計時安培法偵測葡萄糖之 i-t 曲線圖，轉速 2000 rpm，電位為 0.4 V，每 30 秒逐量加入 100 µM 濃度的葡萄糖，各插圖為最小偵測極限與最小定量極限。 .. 61 圖 3- 15 (a) GD/rGO/GOx/Nf, (b) GD/GOx/Nf, (c) rGO/GO/Nf, (d) GOx/Nf 薄膜修飾旋轉電極 i-t 曲線圖之檢量線....................................................................... 62 圖 4- 1 (a)血紅蛋白立體結構，(b)血紅素分子結構 ............................................ 66 圖 4- 2 SEM 圖(a) GD/rGO/Hb,(b) GD/rGO/Hb 放大倍率，(c) GD/rGO/Hb 之 EDS 圖 ............................................................................................................................. 67 圖 4- 3 Hb 修飾於 GD/rGO 電極 XPS 圖譜(a)全圖譜，(b)氮訊號峰 ................ 68 圖 4- 4 血紅蛋白修飾在各不同電極之電化學阻抗圖譜，以 0.1 M KCl 配置 5 mM Fe(CN)63-/Fe(CN)64-電解液，頻率範圍 100 kHz~0.1 Hz ..................................... 70 圖 4- 5 GD/rGO/Hb/Nf 電極在不同 pH 值的 PBS 中(pH 3-11)測得電化學 CV 圖，掃描速率=50 mV/s；插圖為 pH vs.E0 .................................................................. 71 圖 4- 6 (a) GD/rGO/Hb/Nf 電極在 PBS(ph7)中不同掃描速率之 CV 圖，由 0.1 到 1 V/s，掃描範圍從 0 V 到-0.9 V，(b)掃描速率 vs.反應電流 ............................ 73 圖 4- 7 (a) GD/rGO/Hb/Nf, (b) GD/Hb/Nf, (c) rGO/Hb/Nf, (d) Hb/Nf 電極在除氧過的 0.1 M PBS(pH7)中依序加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mM 過氧化氫之 CV 圖，電位範圍 0 V 到-0.9 V，掃描速率 50 mV/s ................................................ 74 圖 4- 8 各個不同薄膜修飾在旋轉電極上，在 PBS (pH7)中利用計時安培法偵測過氧化氫之 i-t 曲線圖，轉速 2000 rpm，電位為-0.4 V，每 50 秒逐量加入 500 µM 濃度的過氧化氫 .............................................................................................. 76 圖 4- 9 (a) GD/rGO/Hb/Nf, (b)GD/Hb/Nf 薄膜修飾在旋轉電極上，在已除氧 PBS (pH7)中利用計時安培法偵測過氧化氫之 i-t 曲線圖，轉速 2000 rpm，電位為-0.4 IX.

(11) V，每 50 秒逐量加入不同濃度的過氧化氫 ........................................................ 77 圖 4- 10 (a) GD/rGO/Hb/Nf, (b) GD/Hb/Nf 薄膜修飾旋轉電極 i-t 曲線圖之檢量線 ............................................................................................................................. 78. X.

(12) 表目錄表 2-1 X-ray 光源靶材性質………………………………………………………….21 表 2-2 樹狀金電鍍條件………………………………………………………………37 表 3-1 GOx 常使用電子傳遞媒介物種……………………………………………..42 表 3-2 不同材料電極製備葡萄糖生物感測器之電化學參數比較…………………63 表 4-1 不同材料電極製備葡萄糖生物感測器之電化學參數比較………………....78. XI.

(13) 第一章緒論 1.1 感測器介紹現今有許多各式各樣的感測器(Sensor)在各個不同領域中廣泛的應用著，在日常生活中，多數電化製品、汽車及機器等，都必須用到感測器。這些感測器主要是利用熱、光線、及壓力等物理量的變化來測量，因此稱之為物理感測器(Physical sensor)，例如溫度計、壓力計等皆是屬於此類。另外有些感測器應用在化學物質之偵測，稱之為化學感測器(Chemical sensor)，最早是利用氣體電極感應氫離子濃度而製成，例如 pH 電極。而後量測離子的各種離子選擇性電極也陸續被發現，甚至於半導體、陶瓷、固體電解質等材料，也都應用到氣體電極上。1 感測器是一種接收信號或刺激並反應的元件，藉由控制系統中可量測的物理量，由監視系統輸出後，可經由系統轉換輸出成電流訊號，再回饋到控制器的元件。2 隨著科技的進步，衍生出的感測單元更加多元，依轉換機制來分類，大致上可分為物理感測器、化學感測器、生物感測器等三大類。而感測器的組成可分為兩部分: 分子辨識單元(Molecular recognition unit): 3 是用來偵測分析物，生產的方式可分為兩種(1)生物感測器(Biosensor):以酵素、抗體，抗原等生物體所產生的物質來做辨識;(2)化學感測器(Chemical sensor)以化學 1.

(14) 方法合成對分析物有辨識功能的物質。4 感測器組成第二部分即是物理化學轉換器(Phsicochemical transduser):是將辨識的行為轉變為可被儀器測到的訊號，訊號有三種型式: (1)電化學電極(Electrochemical electrode);(2) 光學訊號 (Optical. signal);(3) 光電生波訊號. (Optical-electronic acoustic signal)。當一個感測器的輸入和輸出完全成線性關係的時候，這個感測器就是一個理想感測器。同時，理想感測器還應該遵守以下原則： (1)只受被測因素的影響； (2)不受其他因素的影響； (3)感測器本身不會影響被測因素。當然感測器依據其功能的不同可分為不同類型，但大多數具備以下特性: (1)尺寸越小越好，並且操作容易、易於校正。 (2)操作範圍寬廣，且準確。 (3)感測器應具有高穩定性，操作過程中感測器不應該經常失效。 (4)感測器購買、安裝和操作的花費應盡可能低。 (5)轉換器應該在最小時間回應感測變數的改變，故偵測反應最好是瞬時的。. 2.

(15) 1.2 化學感測器化學感測器(Chemical sensor)通常是指體積小、靈敏度高，且對特定有機、無機或生化醫學物質具有相當高選擇性之偵測器。化學感測器是能將量測物的化學訊號轉換成物理訊號的裝置，而化學訊號可由分析物進行的化學反應產生，或是由量測系統的物理性質得到。一般電化學式的感測器是以三電極式包含工作電極(Working electrode)，輔助電極(Counter electrode)，和參考電極(Reference electrode)之電化學系統，在合適的電位範圍下(Potential window)下施加電壓，讓溶液內的物質在電極表面進行快速的氧化還原反應。電化學感測器目前依照其量測之電化學性質又可區分為電阻式(Conductometric)、電位式 (Potentiometric)、及電流式(Amperometric)。5 1. 電阻式(Resistance): 此類感測器利用電解液(Electrolyte)之電導(Conductance)或是電阻 (Resistance)改變進行量測，而此類感測器施加的電位皆較低，以防止電極表面產生電化學反應而產生法拉第電流(Faradic current) 影響其感測之結果。由於是利用非法拉第電流進行量測，因此電雙層(Double layer)及電極表面之極化(Polarization)皆須加以考量。 2. 電位式(Potentiometric): 在使用電位式感測器時，並不施加電流於工作電極上，或是僅施 3.

(16) 加很小之氧化或還原電流，使得感測物質在電極表面達到平衡狀態;在參考電極上則是有已知濃度的感測物質。此類感測器乃利用濃度電池(Concentration cell)的原理，因感測物質濃度在工作電極以及參考電極上濃度不同而產生一個電位差 ∆E，根據 Nernst 方程式(1-1): ∆E =. RT C ln nF C ∗. (1 − 1). 其中 R: 氣體常數 (=8.314 J·mol·K-1) T:絕對溫度(K) n:反應之電子轉移數. F:法拉第常數(=96485C). C:工作電極上待測物濃度. C*:參考電極上待測物濃度. 假設在參考電極上之感測物濃度已知，則可利用上述方程式由量測所得之電位求得在工作電極上感測物之濃度。在量測上需要注意若待測感測物濃度與已知感測物濃度接近時，精確度將受到影響。 3. 電流式(Amperometric): 在電流式感測器的操作過程中，工作電極被施加電位使得感測物質在電極表面進行氧化或還原反應，且此感測物質在電極表面之反應速率遠大於感測物質由溶液中擴散到電極表面之擴散速率。也就是將反應的條件控制在擴散控制(Diffusion control)的狀態下。此時反應的速率取決於溶液中感測物質擴散到電極表面之速率。 4.

(17) 而分析過程中，通常會盡量降低對流以及離子遷移效應所造成的影響，使感測物質只靠質傳的效應傳送到電極表面。例如可使用旋轉電極控制擴散層以降低對流的影響，在溶液中加入大量的支援電解質以降低離子遷移效應。感測物擴散至電極表面的速率 (𝑣𝑚𝑡 )與溶液中感測濃度(𝐶0𝑏 )以及感測電流大小(i)之關係可用下式表示(1-2): 𝑣𝑚𝑡 =. 𝑖 = 𝑚0 [𝐶0𝑏 − 𝐶0 (𝑥 = 0)] 𝑛𝐹𝐴. 其中 vmt : 質傳速率 mole/cm2 ∙ sec. (1 − 2). A: 電極面積cm2. m0 : 感測物之質傳係數(Mass transfer coefficient)cm/sec C0b :感測物在溶液(Bulk solution)之濃度 M,mol/cm3 C0 (x = 0): 感測物在電極表面之濃度M,mol/cm3 當反應在質傳控制的狀態下，無論有多少感測物質擴散至電極表面，皆會立即發生氧化還原反應，因此感測物在電極表面之濃度為零，即C0 (x = 0) = 0，此時所量測之電流稱為極限電流(Limiting current)，以𝑖𝑑 來表示。 id = nFAm0 C0b. (1 − 3). 由上式(1-3)可得知感測的極限電流大小，與溶液中感測物質之濃度成正比。故可以藉由量測感測電流得知感測物質之濃度。. 5.

(18) 1.3 生物感測器 6 生物感測器（Biosensor）隨著生物科技產業發展，朝向生物技術結合電子電路的智慧型感測方向發展。其檢測範圍廣闊且檢測方法日新月異，如在藥品、代謝與其他生物分子間交互作用的測定上已有相當的應用。生物體本身就具有各式各樣的化學量感受器，包括味覺、嗅覺、內分泌系統的荷爾蒙受體，神經傳導系統的神經化學傳遞物質與受體蛋白質，酵素與基質及免疫系統中的抗體-抗原等等。因此，生物體本身實際上式一個化學受體(Chemoreceptors)的集合體。這些化學受體均具有高度的特異性、選擇性與靈敏度，而且絕大部分屬於受體蛋白質分子。生物感測器定義為 ” 使用固定化的生物分子 (Immobilized biomolecules)結合換能器，用來偵測生體內或生體外的環境化學物質或與之起特異性交互作用後產生回應的一種裝置”。其構造是利用生物感測元件（如酵素、抗體等）來將系統中的化學物質（如葡萄糖、血漿濃度、鉀離子濃度、膽固醇…）改變量，轉換成電子訊號或光學訊號的一種可測定微量成份的分析裝置。如圖 1-1 所示:. 6.

(19) 圖 1- 1 生物感測器組成基本元件示意圖 7. 1.4 電化學生物感測器技術 8 此類型的感測器發展的最早，Clark 和 Lyons9 首先開發出酵素電極生物感測器，以電流計測方式測定溶液中葡萄糖的濃度。一般而言，酵素電極之測定濃度範圍約在 mM 到 ppm 之間，其回應時間在 0.1 到 10 分鐘。電極之安定性(Stability)在 1 到 100 天之間。另外，此類型生物感測器亦可使用含有活性酵素之整體細胞，如微生物、動、植物細胞切片來製成特定用途之生物感測器。大部分的生化代謝型生物感測器均使用特定的電極當作訊號轉換器，如溶氧電極、白金電極、氨電極、二氧化碳電極與 pH 電極等。電化學生物感測器結合了生物的感測層特異性，以及電化學的靈敏、 7.

(20) 微型、線性反應、反應時間短等優點，將生物或化學感測結果轉成電子訊號，且此訊號強度與分析物濃度成正比，一般可分為電流式、電位式、電導式三種。酵素電極的測定原理為利用特定電極量取反應產物之生成量或反應物之消失量。例如使用葡萄糖氧化酵素(Glucose oxidase, GOx)固定化在溶氧電極上來定量反應溶液中氧氣的濃度，當葡萄糖被 GOx 氧化時：加入 GOx 催化下列反應: Glucose + O2. Gluconolactone + H2O2. 溶液中氧氣遞減現象可由溶氧電極量測出，而氧氣消耗量與葡萄糖濃度成正比例關係。由於糖尿病的普及和危害，目前應用最廣的電化學生物感測器應為血糖計，糖尿病患者將血糖控制在 80~120 mg/dL 是極重要的，最早的血糖計即為前述的 Pro. Clark 於 1962 年在辛辛那提兒童醫院所發展的電流式葡萄糖酵素電極，它依賴於一種通過半透膜、包覆於溶氧電極的葡萄糖氧化酶薄層來進行偵測，訊號是由氧氣在酵素催化下的消耗量決定，並由加在白金電極的負電壓進行反應來偵測其消耗程度。. 8.

(21) 1.5 電化學分析法電化學的應用領域非常的廣，舉凡感測技術、能源轉換、光電技術、半導體電子產業等，都可涉及到電化學相關技術，在電化學的研究裡，最重要的是運用不同電位高低的技巧，來促使化學反應進行；因此可以藉由電位(或電流)迫使某些在常態下無法進行的反應發生。電化學反應是一種伴隨著電荷(電子)轉移的化學反應，而且此電荷轉移發生在電解質與電極之間。電解質是靠離子的移動達到導電目的，而電極上的導電方式主要是靠電子的移動來完成；由於金屬本身擁有極多的自由電子，因此常被當作電極。在感測技術中，電化學分析可以產生極低的偵測極限和描述包括介面電荷轉移的化學計量和速率，質量轉移速率，和化學反應的平衡常數與速率。而對於電化學感測器，其設計重點在於表面結構與反應性之間的關係，在電化學分析裝置中，感測器大多數需要優異的選擇性、優良的穩定性、高靈敏度、和低偵測極限等條件。電化學生物感測器在生物技術的領域中快速成長，此元件結合了電化學的分析能力與生物分子的特異性。. 9.

(22) 1.6 化學修飾電極玻璃碳電極近年來普遍使用在各項電化學領域中，其具有低電阻、殘留電流小、表面再現性良好等優點，但是依然會碰到干擾物以及一些有機物質而產生鈍化現象影響偵測與再現性；另外，當待測分析物在電極表面反應的速率較慢時，就需再額外增加過電壓，且應用範圍受限，只能偵測具電化學活性的物質；因此，為了改善上述缺點，許多修飾電極的方法便因應而生。最常見為化學修飾電極，10，11是在電極上施以物理或化學性的處理，使電極具備特殊的性質，目的是使電極能對所欲偵測的物質具有催化能力或選擇性，特別是在電極塗覆一層修飾劑，使其兼具修飾劑的特性，以改進電極在應用上的表現。理想的化學修飾電極須具備：製造方法簡單、有良好的機械與化學性質、不錯的再現性與穩定性、背景電流必須低且穩定、可適用於不同溶劑組成的溶液中等條件。製成化學修飾電極的方法，主要可以分為12： 1. 將修飾劑以單層直接吸附於電極表面:Land和Hubbard所發展出早期的電極修飾法，利用修飾劑本身和電極表面的作用力而吸附在電極表面。其優點是製作過程簡單，缺點是吸附在電極表面的修飾物質只有單層，易達到飽和，導致電極上的修飾物質易剝落。 10.

(23) 2. 以共價鍵讓修飾劑與電極表面特定官能基鍵結:在電極表面的官能基和修飾物質，以共價鍵的方式鍵結於電極上。由於共價鍵的鍵結能力較強，可製作出穩定性強，不易剝落的修飾電極。 3. 在電極表面塗覆一層包含有修飾劑的高分子薄膜:將具有離子交換能力的高分子修飾於電極表面，如聚乙烯砒啶(PVP)，全氟硫酸聚合物(Nafion)等離子交換的聚合物修飾於電極表面。 4. 電化學沉積修飾物:將電極置於待析鍍溶液中，使用外加電位將修飾物質沉積於電極表面上，可以調整待析鍍溶液的成分、施加的電位和時間來改變電極的特性。通常化學修飾電極的製成方法並不只限於上述一種方式，而是二種甚至二種以上方法的結合。化學修飾電極可應用在不同範圍，例如，滲透選擇性、電催化、生化選擇性、以及非電活性物質的偵測。本篇研究以電化學沉積法及高分子修飾法在玻璃碳電極上製備薄膜修飾電極，可分別偵測葡萄糖及過氧化氫。. 1.7 石墨烯碳元素有很多同素異構物，其中石墨、富勒烯和奈米碳管在複合材料中是很好的補強材料，尤其是石墨，在 2010 年諾貝爾物理學獎發表後，石墨烯(Graphene)的研究更成為材料科學家的焦點。13，14 由於其獨特的材料特性，如高機械強度 (~1100GPa) 、熱傳導 11.

(24) (~5000Wm-1K-1)，以及高載子遷移率(200000cm2V-1s-1)等優異的特性。 15. 因而引起物理學家化學家的矚目，成為近期研究上的熱點。石墨烯為單一層碳原子以 sp2 方式鍵結成蜂巢晶格狀的二維結構，. 石墨本質上是石墨烯藉由弱的凡德瓦力層層緊密堆疊而成，也被視為是奈米碳管與巴克球的基本單位，可由石墨(Graphite)以低成本大量生產。由於 pi 軌域的電子分散在整個石墨與石墨烯的平面上，所以有良好熱與電的傳導性。由於石墨是由石墨烯以弱的凡德瓦力層層堆積而得，層間距大約 0.35nm，所以層與層間相對地容易移動，16 如圖 1-2 所示。. 圖 1- 2 石墨烯結構示意圖然而要將此材料推向實際應用，必須要發展出一個大面積且高品質合成石墨烯的製備方法。過去製造石墨烯的技術包含機械剝離法（Mechanical exfoliation）、磊晶成長法(Epitaxial growth)、17 化學氣相 12.

(25) 沈積法（Chemical vapor deposition, CVD）18 及化學剝離法（Chemical exfoliation）等。其中化學剝離法是利用氧化石墨塊來剝離石墨烯氧化物，此法有別於其他合成方法，具有規模化量產、溶液式製程，且容易進行後續的化學改質等優勢。. 1.8 氧化石墨烯與還原態氧化石墨烯 19 氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)20 的氧化方法早在 1859 年由 Brodie20 將石墨在氯化鉀與發煙硝酸中進行氧化，後來在 1958 年 Hummers21 等人發展出更為安全且更有效的氧化方法，他們將石墨置於濃硫酸中，加入硝酸鈉與過錳酸鉀作為氧化劑，此氧化方法至今能被廣泛使用，並出現許多改良式的 Hummers 方法，如使用硫酸與磷酸混合液的改良式方法亦能有效地氧化石墨。而就材料的電化學特性來說，石墨烯氧化物呈現與完美石墨烯迥異的電子結構，但氧化石墨烯為因為表面氧官能基因此產生絕緣性，而藉由化學、22 熱、23 光熱 24. 、以及電化學. 25，26. 處理可進行還原來移除氧化基團的含量，將可. 以調變其電子結構由絕緣性轉變為能隙為 3.39eV 的半導性，而進一步還原將能轉變為導電性，因此，其還原態(Reduced graphene oxide, rGO)27 具有可調控的表面化性，電性與光學特性，近期已經被演示可利用在透明電極，生化感測器，28，29 超高電容器，30 染料敏化太陽能電池 31、有機太陽能電池 32 以及薄膜電晶體 33 等應用。 13.

(26) 圖 1-3 為 GO 與 rGO 表面形貌的 SEM 圖像，19 圖(a)可清楚觀察到片狀的 GO 層與層之間不緊密的堆疊，圖(b) rGO 則顯示單薄透明狀且表面積型態更大、更緊密，由於片狀石墨烯經由氧化劑將含氧極性官能基導入石墨平面上，這些含氧官能基(Oxygen functional groups) 的導入，使得層間距變得更大，一般石墨氧化物的層間距從原本 0.34 nm 擴大到 0.78 nm，層間距變大，表示要使層與層分離越容易；而氧化石墨烯其化學結構如圖 1-4 (a)所示，基本上形貌仍維持石墨烯的六角晶格結構，而石墨烯的表面有羥基(hydroxyl group)和環氧基(epoxy group)等大量含氧官能基，而邊界處則分佈羧酸(carboxyl group)和羰基(carbonyl group)。34 圖 1-4 (b) 為分子動力學所模擬石墨烯氧化物還原後的原子結構。還原後的石墨烯氧化物呈現出許多的缺陷結構以及殘餘的氧化基。因此即便有許多還原方法被提出，但仍無法獲得近乎石墨烯完美晶格的結構，即便如此，其簡單的製程及其溶液的可加工性，在考量量產的工業製程中，GO 與 rGO 已成為製造石墨烯相關材料及元件極具吸引力的前驅物。. 14.

(27) 圖 1- 3(a) GO, (b) rGO 之 SEM 圖。19. 圖 1- 4(a)石墨烯氧化物之化學結構，(b)還原後的分子模型。35，36 在廣大的研究熱潮和競爭之下，陸續有研究團隊針對這些問題提出令人振奮的解決之道。因此，不久的將來可期待碳科技新世代的來臨；近幾年許多研究團隊將石墨烯搭配了各式不同金屬製成材料應用， 15.

(28) 皆得到良好的效果， Coskun Kocabas 37等研究團隊在金片上將化學氣相沈積法而得的石墨烯結合並製成電晶體應用，以及Feng Yan38研究團隊利用葡萄糖氧化酶與Nafion修飾rGO製備電晶體之閘極並偵測葡萄糖，本研究將石墨烯修飾於樹狀金電極分別製備成葡萄糖氧化酶與血紅蛋白酵素電極，對此葡萄糖與過氧化氫之偵測。. 1.9 脈衝式電流電化學沉積法對於定電流沉積法，可分為直流電和脈衝式電鍍方法。直流電沉積是最常見的技術，但因為沉積物的成長會受限於擴散限制電流時的質傳效應，近年來，則開始使用脈衝式電流沉積法 39 來完成奈米結構的沉積。根據過去的研究，脈衝式沉積法製備出的奈米粒子有以下優點：適宜的粒徑大小、顆粒分佈均勻和附著力強等。脈衝式電流電化學沉積可利用脈衝電流密度(ip)、脈衝電鍍時間 (Ton)和電鍍釋放時間(Toff)等參數變化，提供更多改變沉積物屬性的空間。沉積時，電極表面只有極短的時間內有電流值通過，進而快速進行還原反應，在電極表面沉積欲成長之金屬。. 16.

(29) 圖 1- 5 脈衝式電流電化學沉積法參數示意圖如圖 1-5 所示，直流電沉積法可控制的參數只有電流密度，而在脈衝方波可控制脈衝電流(ip)，脈衝時間(Ton)和電鍍釋放時間(Toff) ， Ton+Toff 為一脈衝週期(Pulsed period)。在只有直流電通過時是屬於離子自電解溶液擴散至電極表面的過程，而有脈衝電流通過時是屬於材料沉積的步驟，所以材料沉積時間極短又快，故相對於一般直流電化學沉積之好處在於可改善成核現象、形成較為小晶體以及減少晶體成長之缺陷等。. 1.10 三維樹狀金電極 40 本實驗室以脈衝式電化學沉積法，在玻璃碳電極上成長三維樹狀金，在四氯金酸溶液中添加半胱胺酸(L-cysteine)，製造出三維立體樹狀的金基材。這是由於吸附在金（111）面的半胱氨酸於施加電壓下會脫附，而在金（110）和金（100）面的半胱氨酸仍舊吸附於金表面上，故有封鎖和保護的效果，如圖 1-6 所示。因此，金會沿著（111）面進行生長。沉積而成的晶體其主莖及其分枝，經 TEM 及 XRD40 証 17.

(30) 實皆沿著金（111）面成長。此三維立體樹狀結構並可藉由沉積電位和添加物濃度的不同來控制成長之構型，如圖 1-7 所示。. 圖 1- 6L-cystein 在樹狀金電極上之脫附 CV 圖 40. 圖 1- 7 三維樹狀金電極成長機制 40 18.

(31) 第二章儀器與實驗藥品 2.1 儀器介紹 2.1.1 X-ray 光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）41. ，42. XPS 為一種表面化學分析技術，用於測定材料中元素構成、實驗式，以及其中所含元素化學態和電子態的能譜。當 X-ray 照射到材料時，若光子能量(hν)大於元素內層軌域的束縛能(Eb)，則此電子便會被游離成為自由電子，稱此自由電子為光電子，如圖 2-1 所示，光源產生入射 X-ray 使電子自內層游離，此游離電子為光電子或一次電子，. 圖 2- 1 光電子的激發過程而真空能階與費米能階的能差稱為功函數(ω)，功函數會因不同的分 19.

(32) 析器而不同，入射的 X-ray 光子能量為(hν)，不同的元素其內層電子的束縛能(Eb)皆不相同，藉由分析器量測一次電子的動能(Ek)，若電子是彈性碰撞的理想狀況下能量應如式 2-1 所示： 𝐸𝑏 = hν − 𝐸𝑘 − ω. (2 − 1). 束縛能小於光子能量的電子都可相當精準的顯示在光譜上，如圖 2-2 所示，光電子能譜可表述出電子軌域，電子在激發及脫離的過程中沒有能量的流失，此即為該元素的特徵峰，而在過程中有因非彈性碰撞並且損失能量的電子則以背景訊號的方式顯示在光譜中，而被激發的游離電子會以不同的方式釋放能量，常見的方式有釋放出 X-ray 光子此稱為 X-ray 螢光，此光子能量有一定的機率激發出歐傑電子，此稱為 X-ray 誘導歐傑電子(X-AES)亦可提供相當的光譜資訊。. 圖 2- 2 XPS 圖譜與原子能階 20.

(33) 圖 2- 3 XPS 基本構造簡圖 43 X-ray 的陽極材料需考慮光源的穿透度和足以激發元素週期表上的所有元素產生相當強度之光電子訊號的光子強度，X-ray 的線寬亦不可過寬造成光譜解析下降。最常見的陽極材料是鎂靶和鋁靶，表 2-1 為 X-ray 光源的靶材性質。表 2-1 X-ray 光源靶材性質. 21.

(34) XPS 的光電子分析器分為圓筒狀反射分析儀(Cylindrical Mirror Analyzer，CMA)和半球形能量分析儀(Hemspherical Energy Analyzer， HEA)兩種類型，目前最常使用後者，如圖 2-4 所示，只要由兩個同軸但不同半徑(R1、R2)的半球型金屬殼組成。. 圖 2- 4 半球形能量分析儀剖面圖(Hemspherical Energy Analyzer, HEA) 其原理主要是利用在兩個半球形金屬殼具有電位差(半徑為 R0 的區域會有一等電位面 V0)，將造成光電子路徑的偏轉，在某特定電位差僅能讓具某特定能量的電子通過兩個半球形金屬殼間之空隙，到達電子束偵測器，其電位差與電子能量的關係如 𝑉1 − 𝑉2 = 𝑉0 (. 𝑅2 𝑅1 − ) 𝑅1 𝑅2. (2 − 2). 簡略而言，依此式改變電位差就可擷取光電子能量分佈曲線；至於電 22.

(35) 子能量分析儀的能量解析度(ΔE/E)是依於公式 𝑤2 (δα)2 ∆𝐸 ⁄𝐸 = 𝑤1 + + 2𝑅0 4. (2 − 3). R0 為平均半徑；電子能量分析儀的平均半徑愈大，解析度愈大，但也增加設計製造的複雜與困難，常用的大小為 100-150 mm。入口狹縫為 w1，出口狹縫為 w2。樣品表面被激發出的光電子進入收角(α)，在接收立體角(δα)內的反射電子、二次電子或歐傑電子等都可通過半球形能量分析儀。. 2.1.2 循環伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)44 循環伏安法其基本觀念即是限定一個電位範圍，對工作電極施加電位後做一連續且循環的電位變化，使其與溶液中之電活性物質發生氧化還原反應(即法拉第反應)，其中還包括物質的吸附、脫附，以及由於電雙層電荷(Double layer charging)所產生之電容電流(Capacitive current)，可得電流-電位圖，由圖形可再進一步做電化學的探討。藉由循環伏安法，可以瞭解反應物種的電化學活性、氧化還原電位，與反應速率的定量分析，此外還可用來估算觸媒活性面積。實驗過程中，電位於正向掃描後，再負向掃描至起始電位，其變化為一三角波型態，如圖 2-5 所示。. 23.

(36) 圖 2- 5 (a)循環伏安法之波形，(b)循環伏安法 CV 圖 45. 一個典型的 CV 圖形，可從一個 CV 實驗中得到的四件重要資訊，陰極峰值電流(Cathodic peak current，𝑖𝑝𝑐 )、陽極峰值電流(Anodic peak current，𝑖𝑝𝑎 )、陰極峰值電位(Cathodic peak potential，𝐸𝑝𝑐 )及陽極峰值電位(Anodic peak potential，𝐸𝑝𝑎 )，如圖 2-5 (b)，由較正的電位掃描到 24.

(37) 較負的電位時，會使溶液中的分析物發生還原反應，在 CV curve 上產生一個還原電流(𝑖𝑝𝑐 )，此時峰值電位稱之還原電位(𝐸𝑝𝑐 )；相反地，由較負的電位掃描至較正的電位時，則會使分析物發生氧化反應，而在 CV curve 上產生一個氧化電流(𝑖𝑝𝑎 )，此時峰值電位稱之氧化電位 (𝐸𝑝𝑎 )。因此，我們可以藉由 CV curve 來判斷分析物在哪個電位下是進行氧化、或者是還原反應。. 2.1.3 電化學交流阻抗 (electrochemical impedance spectroscopy, EIS)46 電化學交流阻抗分析是電化學測量中有效的分析技巧之一，可應用於半導體、電池及薄膜材料之電化學特性研究。其原理即是施加一個小振幅的交流電 (一般為正弦波)於量測系統之電極上，使電極電位在平衡電位附近微擾，在達到穩定狀態後，測量其響應電流的振幅和相角，依此計算出電極的阻抗函數，然後根據設想的等效電路，應用軟體將其分析之電路繪出加以分析，圖 2-6 為一般電化學感測系統常見的等效電路圖，稱為 Randles equivalent circuit，Cd 是電極上電雙層(double-layer)的電容；Rs 是溶液的電阻；Rct 是電極上電荷轉移 (charge-transfer)的電阻；Zw(Warburg impedance)是質傳的電阻，會隨頻率(ω)而改變。. 25.

(38) Rs. Cd Rct Zw. 圖 2- 6 等效電路圖測量時，固定基本起始電位(initial E)，隨著時間對基本電位作正弦波形的震盪，如圖 2-7 所示。由高頻掃至低頻，經電腦記錄並分析電流和電位值，轉成阻抗函數(impedance，Z)的實部(real impedance，Z′) 和虛部(imaginary impedance，Z″)。. 圖 2- 7 時間函數的電位波形由於電化學阻抗圖譜利用偵測阻抗的基本函數來描述物質的行為特徵。因此，必須在複數平面上繪圖，而阻抗函數也可直接轉換成複數的形式來表示即： Z(ω) = Z ′ + jZ ″. (2 − 4). 所以由一連串對應某特性頻率範圍所測得的阻抗所形成之圖形，即稱為交流阻抗圖譜，或稱為奈式圖(Nyquist plot)表示，如圖 2-8.所示。 26.

(39) 我們可利用 Nyquist plot 的半圓直徑，得知電極上材料的電荷轉移之電阻大小。. 圖 2- 8 奈式圖(Nyquist plot)介紹. 2.1.4 安培法(Amperometric, i-t curve) 此處所謂的安培法，是藉著外加電位，讓電位維持在可以使待測物反應之固定值。隨著待測物種加入，於電極上之反應量會表現在電流的變化上，可得時間對電流(i-t curve)圖，通常電流變化量會與加入待測物濃度成比例關係。因此，於實際量測上，當偵測體系唯一攪拌狀態下例如旋轉電極系統中，則可藉由記錄到時間-電流的反應曲線。根據法拉第定律得知: I=. dQ 𝑑𝑁 | = 𝑛𝐹 | dt 𝑡 𝑑𝑡 𝑡. (2 − 3). 其中𝐼𝑡 為時間 t 時的電流，Q為通過之電荷，𝑁為反映物或生成物之莫耳數，根據 Fick’s 定律與法拉第定律結合可知:. 27.

(40) 𝐼𝑡 = 𝑛𝐹𝐴𝐷. 𝜕𝐶 | 𝜕𝑥 𝑥=0. (2 − 4). 其中n為電子轉移數，F為法拉第常數，A為電極表面積，D為擴散係數。由此方程式可得知計時安培圖的形狀會受到電極表面的濃度梯度影響。本研究另於工作電極施加一個固定轉速。開始偵測電流變化時可能因為轉動的電極而造成電流微幅出現，就算不加電極催化活性物質也會有一定的電流訊號緩慢攀升或下降。此時等待電流至一定程度成平緩趨勢後，注入待測物觀察，濃度大小與時間間隔可以需求自行設定。所得時間-電流曲線可計算此修飾薄膜對於此待測物質間的定量關係。包括偵測極限，偵測區間，靈敏度及穩定程度等電化學中常用的標定標準皆可用此技術得知。. 2.1.5 拉曼光譜(Raman spectrum)47 拉曼是一種光散射技術，拉曼散射(Raman scattering)是印度物理學家拉曼（C.V. Raman）在 1928 年首先發現。他發現某些分子的散射其一小部份的波長與入射光不同，且波長的位移依散射分子的化學結構而定。拉曼光譜可以提供樣品之化學結構、形態、結晶度以及分子相互作用的詳細資訊。拉曼散射的機制，是當雷射光束對樣品進行照射時，光子會與分 28.

(41) 子碰撞，除了動量有改變外，能量亦有可能進行交換。而拉曼散射為一個非彈性碰撞，其動量的改變會影響光子進行的方向，而能量的改變會使光子的頻率及波數升高或降低。如果只有動量改變，能量不變，亦指波數不變時，且為彈性碰撞，則稱為雷利散射(Rayleigh scattering)，如圖 2-9 所示。. 圖 2- 9 拉曼散射機制 48 一般得到的散射光譜包含拉曼散射及雷利散射，而拉曼散射就是偵側光子能量的改變，也就是分子能量差。關於能量差∆E與拉曼位移∆σ(Raman Shift)的關係，可用以下的公式解釋: ∆σ = σ(入射光光子能量) − σ′ (散射光子的能量) = ∆E⁄hc. (2 − 5). 當入射光不等於散射光時，則稱為拉曼散射。且拉曼散射包括史托克斯側(Stokes side)和反史托克斯側(Anti-Stokes side)。若入射光子波數沒有改變時，而散射的光子得到能量，則稱為史托克斯側(Stokes side)。若入射光子波數沒有改變，散射光子失去能量，則稱為反史托克斯側 29.

(42) (Anti-Stokes side)，如圖 2-10 所示。虛態(Virtual state)為當電子被激發到虛態，分子不吸收該能量，會以散射(Scattering)的方式釋出能量。此釋出的能量若等於入射光子的能量，則此散射光稱為雷利散射 (Rayleigh scattering)。本篇論文藉由拉曼散射圖譜，可以看出氧化石墨烯結構上的缺陷貢獻之 D band，以及石墨本身碳-碳結構 sp2 混成軌域貢獻的 G band 之比值，得知結構上的細部變化。. 圖 2- 10 雷利及拉曼散射過程能階圖可以藉由參考文獻. 49 ， 50 ， 51. 得知，一般六方石墨單晶(Single. hexagonal crystal graphite)點群是 D46h，其中 E2g 在約 1582cm-1 會有一根特徵峰，命名為 G band，被認為是石墨層狀六方平面之中的碳原子與碳原子之間偶合的振動模式。當石墨結構變小並出現缺陷，其振 30.

(43) 動模式為 A1g 並會在大約 1350cm-1 出現一根較寬的特徵峰，命名為 D band。且大約在 1500~1550cm-1 則會在大多數的碳材結構中發現，其中被認為是無晶型結構的 sp2 混成的碳材，命名為 D" band 或 A band。 52. 更精確的說，這類的無秩序排列碳材是與間隙上的缺陷有較大的關係。藉由積分 D band 和 G band 的面積之比值可以清楚知道石墨化程度。其中可以看到振動模式分成 E2g 及 A1g，如圖 2-11 所示。. 圖 2- 11 拉曼散射之振動模式示意圖 53. 31.

(44) 2.1.6 掃瞄式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy, SEM)54 掃瞄式電子顯微鏡主要是來觀察物體的表面型態，其試片製作較簡單，解析度可達奈米尺度且景深長，在觀察材料表面形貌上非常清楚而容易，目前已被廣泛的使用。. 圖 2- 12 SEM 基本構造示意圖 55 其主要構造示意圖如圖 2-12 所示，主要分為電子槍系統(Electron Gun)、電磁透鏡組(Condenser Lens) 與掃瞄線圈(Scanning Coils)等。 SEM 的主要工作原理為電子槍透過熱游離或是場發射原理產生高能電子束，經過電磁透鏡組後，可以將電子束聚焦至試片上，利用掃瞄 32.

(45) 線圈偏折電子束，在試片表面上做二度空間的掃瞄。當電子束與試片作用時，如圖 2-13 所示，會產生各種不同的訊號，如二次電子、背向散射電子、吸收電子、歐傑電子、特徵 X 光...等。. 圖 2- 13 SEM 入射電子產生之訊號在一般掃瞄式電子顯微鏡偵測系統上，主要為偵測二次電子及背向散射電子成像，這些訊號經過放大處理後即可成像觀察，而特徵 X 光則可經由偵測器如：能量分散光譜儀 (Energy Dispersive Spectroscopy；EDS)系統，則可以偵測特徵 X 光作材料元素成分分析。一般電子束聚焦在試片上，試片表面的電子會被撞擊而釋放出來，稱為二次電子，其能量約為 50 eV，因此只有試片表面下約 5~50 nm 的二次電子，才有機會脫離試片表面被偵測，此為試片表面的電子，帶有表面形貌的訊息，被二次電子偵測器接收成像，即可以得到試片表面凹凸的影像。 33.

(46) 2.1.7 能量散射光譜儀(Energy Dispersive System, EDS) EDS 之發展源自 1968 年由 Fitzgerald 等人提出矽(鋰)偵測器 (Silicon lithium solid state detector)，應用在 X-ray 光譜分析上(Energy spectrometer)，讓 X-ray 微分析有了不一樣的進步，並使得 1970 年代結合掃描電子顯微鏡(SEM)系統加上同時可具備 X-ray 能譜分析的 EDS。圖 2-13 為 EDS 結合 SEM 系統示意圖。. 圖 2- 14 EDS 結合 SEM 基本構造示意圖 56 如圖 2-14 所示，EDS 主要利用電子束所激發的特性 X 光來進行待測樣品的定性或半定量化學成分分析。當原子的內層電子受到外來 34.

(47) 能量源的激發而脫離原子時，原子的外層電子將很快的降回至內層電子的空位並釋放出兩能階差能量。被釋出的能量可能以 X 光的形式釋出，或者此釋出的能量將轉而激發另一外層電子使其脫離原子。由於各元素之能階差不同，因此分析此 X 光的能量即可鑑定待測樣品的各個組成元素進而得到材料的成份組成，確認所合成出來樣品的金屬比例與目標比例是否相符。. 圖 2- 15 EDS 原理示意圖 57 EDS 具有許多獨特的優點和半導體檢測的功能，並且使用上簡單，快速，已是半導體工業上必備的工具之一。. 35.

(48) 2.2 實驗藥品 1. 四氯金酸(Tetrachloroauric(Ⅲ)acid trihydrate，HAuCl) : Acros 2. 硫酸(Sulfuric acid，H2SO4):>95%；Fisher Scientific 3. 葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOx):from Aspergillus niger Type X-S.lyophilized powder；SIGMA-ALDRICH 4. 葡萄糖(β-D(+)-Glucose，C6H12O6 ): >95%；AMRESCO 5. 血紅蛋白(Hemoglobin, Hb):from bovine blood；SIGMA-ALDRICH 6. 過氧化氫(Hydroden Peroxide，H2O2):35 wt%；Acros 7. 全氟酸樹酯(Nafion):5wt%；SIGMA-ALDRICH 8. 氧化石墨烯 (Grapheme Oxide ， GO):UR-SLGO carbon(79%), oxide(20%)；GRAPHENE SUPERMARKET 9. 磷酸緩衝液(Phosphate buffer solution，PBS): Fisher Scientific 10. 氫氧化鉀(Potassium hydroxide，KOH):85%；SHOWA 11. 二茂鐵甲酸(Ferrocene monocarboxylic acid，FMCA):98%；AK Scientific Inc. 12. 氯化鉀(Potassium chloride，KCl):99.5%；SHOWA 13. 六氰鐵(Ⅲ)酸鉀(Potassium hexacyanoferrate(Ⅲ)，K3[Fe(CN)6] ):俗稱赤血鹽，99%；SIGMA-ALDRICH 14. 半胱胺酸(L-Cystein):99%，Acros. 36.

(49) 2.3 實驗步驟製備 GD/rGO 複合材料 1. 清洗商用柱狀玻璃碳電極表面 ‧以粒徑大小 0.3 μm 的三氧化二鋁泥漿拋光 ‧再分別以酒精及二次水用超聲波震盪儀震盪 15 分鐘 ‧再以粒徑大小 0.05 μm 的三氧化二鋁泥漿再次拋光，並重複上述步驟，直到電極表面光亮平滑即可。 2. 以 0.5M 硫酸水溶液配置 1.0 mM 四氯金酸水溶液 3. 將清洗乾淨的玻璃碳電極放入含有 0.1 mM cysteine 的 1.0 mM 四氯金酸水溶液。 4. 架設電化學三電極系統，以脈衝式電壓進行金離子的沉積，即可得到樹狀金電極(GCE/GD)。電鍍條件如表 2-2 所示。 5. 將製備好的樹狀金電極以二次水沖洗數次，等待風乾後，在樹狀金電極表面滴上 15 µL (1mg/1mL) 氧化石墨烯(GO)，在室溫下等待乾燥。表 2-2 樹狀金電鍍條件 Star E(V). 0.0. Step E1(V)/i1(A). 0.0. Step Time 1(s). 0.1. Step E2(V)/i2(A). -0.8. Step Time 2(s). 0.1. Step Segment. 30000 37.

(50) 6. 在已除氧的磷酸緩衝液中(pH 5.0)，以電化學循環伏安法還原修飾在樹狀金上的氧化石墨烯，電位設置在 0 到-1.5 V，掃描速率 0.05 V/s，掃描 15 圈，即完成製備 GD/rGO 複合材料。製備 GD/rGO/GOx/Nf 複合薄膜修飾電極將製備完成的 GD/rGO 電極接續滴上葡萄糖氧化酶(GOx) 20 µL (10mg/1mL)，在 4℃環境下乾燥。最後滴入 Nafion(Nf) 2 µL (0.5%)乙醇稀釋溶液，即完成葡萄糖感測電極，放在 4℃環境下待備用。製備 GCE/GD/rGO/Hb/Nf 複合薄膜修飾電極將製備完成的 GD/rGO 電極接續滴上血紅蛋白 (Hb) 25 µL (10mg/1mL)，在 4℃環境下乾燥。最後滴入 Nafion(Nf) 2 µL (0.5%)乙醇稀釋溶液，即完成過氧化氫感測電極，放在 4℃環境下待備用。. 38.

(51) 第三章葡萄糖生物感測器 3.1 前言近年來國內糖尿病患者激增，台灣衛生署報告顯示糖尿病為歷年十大死亡原因之一，且罹病的年齡層逐漸下降，所以血糖偵測器為一重要之研究主題。目前的血糖測試儀多半使用酵素感測電極，由於酵素反映有訊號放大的效果，再加上酵素本身對基質的高選擇性，使得酵素在生物感測器的研發上扮演著重要的角色，可以達到方便、快速與精準的測試結果。將葡萄糖氧化酵素 (Glucose oxidase, GOx) 固定於修飾電極上，可形成強有力的分析儀器，用以偵測患糖尿病人之血糖即為最典型的例子。於製作葡萄糖酵素電極的重要因素之一為電極的材質，電極的材質關係到酵素的固定化、電流傳導及電極的製作成本等。目前使用於製作葡萄糖酵素電極的電極材質，主要分金屬 (含金屬氧化物) 及非金屬的碳兩大類。本實驗將樹狀金與經過還原過的氧化石墨烯形成複合式材料電極，再將葡萄糖氧化酶固定在電極上完成葡萄糖酵素電極。. 39.

(52) 3.2 葡萄糖氧化酶簡介 58 蛋白質能發揮多種多樣的功能，其中催化作用(Catalysis)是重要的功用之一，若催化作用不存在，生物系統內的反應就會進行太慢而無法以適當的速度供應產物給代謝中的生物體。在生物體中執行此功能的催化劑被稱為酵素(Enzyme，即酶)，生物體內所有酵素皆是蛋白質。目前酵素是已知最有效的催化劑。此外，酵素具有高特異性，可區分一個化合物的立體異構物，在很多情形中，酵素的催化作用是藉由控制程序精細地被調整。葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOx)能專一地將 β-D(+)-葡萄糖氧化成葡萄糖酸並產生過氧化氫。59 由於 GOx 能夠利用氧氣將葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效去除氧，因而被廣泛用作抗氧化劑、葡萄糖酸、糖尿試紙和生物感測器的發展，其產品應用於醫藥領域、食品加工業、飼料行業和科學研究等各方面。葡萄糖氧化酶是由 Muller 於 1928 年首先從黑麴黴（Aspergillus niger）的萃取液中發現。1960 年 Kusai 等人、1964、1965 年 Pazur、 Swobodda 等人分别從青黴素黴和黑麴黴纯化葡萄糖氧化酶。60 葡萄糖氧化酶屬於雙體蛋白質，其中每一個單體含有一個 Flavinadenine dinucleotide (FAD)作為其輔酶(Cofactor)。是生物活性的來源，因此失去輔酶 FAD 的葡萄糖氧化酶也就喪失了催化活性。61 40.

(53) 3.3 葡萄糖生物感測機制葡萄糖氧化酶能在具有氧氣的條件下，將 β-D-glucose 催化成為葡萄糖酸內酯(gluconolactone)再水解成葡萄糖酸(gluconic acid)，且具有高度專一性，同時生成副產物過氧化氫（H2O2），其間會消耗掉氧分子作為電子的接受者（electron acceptor），62 反應如圖 3-1 所示。. 圖 3- 1 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反應方程式在此反應中葡萄糖是我們欲偵測的分子，且為葡萄糖氧化酵素的基質。為了知道液體中有多少葡萄糖，我們可以測量反應溶液中氧氣的消耗量，此數據可以決定酵素的催化反應是否正在進行，以及進行的速度。利用酵素的自然反應完成偵測屬於第一代葡萄糖生物感測器的設計，必需利用氧電極或過氧化氫電極配合葡萄糖氧化酶量測，然而此反應機制必須依賴溶液中溶氧濃度，為了克服此問題，研發了以非生理物質之”電子傳遞媒介物”幫助酵素當作電子提供或接受者，即為第二代葡萄糖生物感測器的設計概念，其反應機制如下: 63 41.

(54) Glucose + GOx(FAD) GOx(FADH2 ) + 2M. Gluconolacton + GOx(FADH2 ) GOx(FAD) + 2M ′ + 2H +. (3 − 1) (3 − 2). 再利用電極配合電子傳遞媒介物(M, mediator)來偵測: 2M ′. 2M + 2e−. (3 − 3). 其中常使用的 Mediator 如表 3-1 所示，本研究是利用 Ferrocene carboxylic acid (FMCA)64，65 做為電子傳遞媒介物。因為 FMCA 具有可溶於水與低氧化還原電位等優點。 Enzyme. Mediator. Glucose oxidase. 1,1-dimethyl ferrocene Ferrocene Vinyl ferrocene Ferrocene carboxylic acid Hydroxy methyl ferrocene [Ru(CN6)]4Benzoquinone NMP TTF RCNQ [Fe(CN6)]4-. Redox potential (vs.SCE)/mV 100 165 250 275 185 685 39 -161 300 127 180. 表 3-1 GOx 常使用電子傳遞媒介物種 63 使用電子傳遞媒介物有以下優點: 63 1. 偵測系統不受氧氣濃度影響。 2. 酵素電極之工作電位由 Mediator 氧化電位決定。 3. 使用 Mediator 的偵測系統其工作電位通常較低，因此可避免會干擾系統的副產物產生。 42.

(55) 4. 若還原態的 Mediator 氧化反應無氫質子的參與，則酵素電極較不受系統 pH 的影響。. 3.4 結果與討論 3.4.1 氧化石墨烯之電化學還原(rGO) 本研究利用電化學循環伏安法. 66，67. 還原修飾在樹狀金電極(GD). 的氧化石墨烯(GO)，所使用的儀器是 CH Instrument model 614B series electrochemical analyzer。圖 3-2 為 GO/GD 電極在磷酸緩衝溶液中 (pH5.0)電位範圍從 0 到-1.5 V 之還原 CV 圖。過程中，第一圈即可看到明顯的還原峰在電位-1.25 V，這是表面 GO 的氧官能基團，68 例如羥基(C-OH)、還氧基(C=O)、羰基(C-O)和羧基(COOH)等鍵結的還原。. 圖 3- 2 GD/GO 電極在 PBS 緩衝液(pH 5.0)電化學還原 CV 圖，掃描速率=50 mV/s。 43.

(56) 3.4.2 還原態氧化石墨烯-樹狀金複合材料(GD/rGO)結構鑑定 3.4.2.1 SEM 分析本研究以 XPS、Raman、SEM 和 EDS 分析研究，鑑定其結構與表面型態，首先以 SEM 研究分析，觀察 GD/rGO 複合材料表面之型態。如圖 3-3 (a)為樹狀金以及(b)還原後的氧化石墨烯覆蓋修飾在樹狀金電極上之比較圖。從圖中可清楚看到經電化學還原後的氧化石墨烯在樹狀金上呈現透明皺褶狀，與單獨樹狀金的表面型態比起來相差甚多；當氧化石墨烯表面官能基進行還原後，使結構中的 sp2 變多，可使導電率(Conductivity)提高，修飾在樹狀金上可以再增加電極整體導電率。. 44.

(57) 圖 3- 3 SEM (a)樹狀金電極(GD), (b) GD/rGO 複合材料。. 3.4.2.2 XPS 分析本論文以 XPS 做結構鑑定，所使用的儀器是 PHOIBOS Hemispherical Energy Analyzer；藉由 XPS 圖譜來佐證氧化石墨烯(GO) 在樹狀金上還原成石墨烯(rGO)。本論文以 Mg Kα X-ray 之光源，其能量為 1253.6 eV。圖 3-4 為樹狀金電沉積在玻璃碳電極 XPS 圖譜，圖 3-4(d)樹狀金佔據電極表面，金訊號強度甚強，而圖 3-4 (b)氧(~532 eV)及圖 3-4 (c) 45.

(58) 碳(~284.8 eV)訊號極弱，來自於玻璃碳電極及樹狀金表面些許氧化物。. 圖 3- 4 (a)樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧 O1s 訊號峰，(c)碳 C1s 訊號峰， (d)金 Au4f 訊號峰。圖 3-5 為氧化石墨烯修飾於樹狀金電極 XPS 圖譜，與上圖 3-4 做比較；由圖 3-5 (b)可知氧訊號峰強度極高，電極表面含有大量氧分子，此大量氧官能基團在表面有絕緣作用，使氧訊號位移至~533 eV，圖 4-4 (c)碳之訊號峰分裂為兩根，此為碳-氧官能基的鍵結造成且訊號強度提高並位移至~286.5 eV，證實來自於電極表面之氧化石墨烯 69。圖 3-5 (d)為來自樹狀金電極之金訊號峰。. 46.

(59) 圖 3- 5 (a)氧化石墨烯修飾於樹狀金電極 XPS 圖譜，(b)氧 O1s 訊號峰， (c)碳 C1s 訊號峰，(d)金 Au4f 訊號峰。. 圖 3- 6 (a)GD/rGO 複合材料 XPS 圖譜，(b)氧 O1s 訊號峰，(c)碳 C1s 訊號峰，(d)金 Au4f 訊號峰。 47.

(60) 經過電化學循環伏安法還原氧化石墨烯後得圖 3-6 (a) XPS 圖譜，與上圖 3-5 做比較，圖 3-6 (b)氧訊號峰(~532.3 eV)降弱，圖 3-6 (c)碳訊號峰(~284.7 eV)不再開裂為兩峰且半高寬變窄。證實石墨化程度提高，已將原本氧之官能基團多數還原。. 3.4.2.3 Raman 分析本論文使用的儀器是 Uni Ram system，利用波長 532 nm 雷射光，並使用顯微聚焦系統，光斑大小為 1 µm，其輸出功率為 20 mW/cm2。我們利用拉曼散射光譜分析經過電化學還原的 GD/rGO 複合材料，藉由參考文獻得知，石墨烯的拉曼光譜在約 1580 cm-1 會有一根稱為 G band 的特徵峰，其振動模式為六方單晶中二維平面碳原子 sp2 之間的偶合，而氧化石墨烯的拉曼光譜在約 1350 cm-1 會看到一根稱為 D band 的特徵峰，為石墨結構中的缺陷與 sp3 鍵所導致的震動模式，值得注意的是 D band 與 G band 的強度比值，如圖 3-7 (a)所示，G band 強度比 D band 些許高出，反之，電化學還原得到的 GD/rGO 圖 3-7 (b) 則 D band 強度高於 G band，這是由於還原後 rGO 的缺陷程度遠大於 GO。此外，rGO 的 G band 位置相較於 GO(1606 cm-1)，紅移至 1595 cm-1，表示經過還原後碳原子更接近石墨烯的六方網狀結構。50. 48.

(61) 圖 3- 7 (a) GD/ GO 複合材料，(b)電化學還原之 GD/rGO 複合材料拉曼散射光譜. 3.4.3 GD/rGO/GOx 修飾電極的電化學阻抗分析本研究透過電化學阻抗(EIS)探討各種不同葡萄糖氧化酶修飾電極的導電性，所使用的儀器是 CH Instrument model 614B series electrochemical analyzer。以 0.1 M KCl 配置 5mM Fe(CN)63-/Fe(CN)64電解液，利用三電極系統量測此電化學阻抗，在玻璃碳電極的表面上修飾不同的薄膜，電極表面的電雙層電容以及電子轉移速率也會有所不同，應用電極反應過程和介面型態去做檢測。圖 3-8 分別為玻璃碳 49.

(62) 電極(GCE)、玻璃碳-葡萄糖氧化酶(GCE/GOx)、樹狀金電極(GD)、樹狀金-葡萄糖氧化酶(GD/GOx)、樹狀金-石墨烯(GD/rGO)、樹狀金-石墨烯-葡萄糖氧化酶(GD/rGO/GOx)，圖中可以明顯看出不同的修飾電極具有不同大小的直徑半圓，表示這些修飾電極有不同的導電性，而電極表面含有 GOx 時皆呈現較大直徑的半圓，代表修飾 GOx 後的電阻抗明顯增加而導電性降低，因為蛋白質高分子的氧官能基團會在電極介面上形成電子傳遞之絕緣層，因此降低了電解液與電極介面處的電子傳遞。70 此外，由圖中也得知樹狀金電極的阻抗遠小於玻璃碳電極，金的樹枝型態使表面積大幅增加因此導電性極好，再者，修飾 rGO 之後因為石墨烯本身獨特的導電性質更進一步幫助電極進行電子轉移的能力。. 50.

(63) 圖 3- 8 葡萄糖氧化酶修飾在各不同電極之電化學阻抗圖譜，以 0.1 M KCl 配置 5 mM Fe(CN)63-/Fe(CN)64-電解液，頻率範圍 100 kHz~0.1 Hz。插圖為 GD/rGO 電極與 GD/rGO/GOx 電極. 3.4.4 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極對 pH 值及掃描速率之研究 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在 PBS 中進行電化學伏安掃描會看到一對 GOx 的氧化還原對(FAD/FADH2)，我們觀察不同 pH 值對 GOx 氧化還原對的影響，圖 3-9 為 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極，在已除氧不同 pH 值範圍 1 到 11 的 PBS 中 CV 圖，由圖可觀察 GOx 51.

(64) 不受 pH 影響，在範圍中皆有明顯的氧化還原對，可推測此修飾電極獲得一個好的再現性；進一步的看到(FAD/FADH2)氧化還原對波峰(Eo) 值會穩定地隨著 pH 值增加而往負電位移動，且反應電流也有增大的趨勢，插圖為 pH 值 vs.形式電位(Eo)檢量線，形式電位和 pH 呈現良好的線性關係，得到斜率為 53.1 mV/pH，此結果接近其他已發表的文獻，且相當接近於能斯特方程式 (Nernst equation) 理論值 -59.2 mV/pH，能斯特方程式如下: Oxidation + n e− + m H + ↔ Reduction. (3 − 4). 在溫度為 25℃時 E = E0 −. [Reduction] 0.0592 log [Oxidation][H + ]m n. (3 − 5). m 1 E = E 0 − 0.0592 ( ) log + [H ] n. (3 − 6). m E = E 0 − 0.0592 ( ) pH n. (3 − 7). 其中，n 為反應中參與的電子數；m 為質子數目，因此由方程式可得知 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極質子與電子轉移比例幾乎相等。. 52.

(65) 圖 3- 9 GCE/GD/rGO/GOx/Nf 電極在已除氧不同 pH 值的 PBS 中(pH 1-11)測得電化學 CV 圖，掃描速率=50 mV/s；插圖為 pH vs.E0。圖 3-10 顯示 GD/rGO/GOx/Nf 電極在已除氧的 PBS 中不同掃描速率的循環伏安圖，掃描速率從 10 mV/s 到 1000 mV/s，插圖為Ipa 和Ipc與掃描速率之檢量線，氧化還原電流與速率成呈現線性關係，表示此修飾電極為薄膜表面直接電子轉移行為(Surface electron transfer)，此外，我們可以利用此線性回歸計算出 GOx 電化學表面覆蓋濃度(Γ)由 Laviron’s equation: 71 n2 F 2 vAΓ Ip = 4RT. (3 − 8). 其中，n為每一反應物分子的電子數(n=2)、 F=96485 為法拉第常數、 Ip =1.0× 10−4 A為電流值、v=0.1 V/s 為掃描速率、A=0.07 cm2 為電極表面積，氣體常數R=8.314 JK-1mol-1，T=298 K，經計算得到 GOx 表 53.

(66) 面覆蓋濃度Γ= 3.81×10-9 mol·cm-2。而 GCE/GD/rGO/GOx/Nf 的葡萄糖氧化酶電子轉移速率常數(k 𝑠 ) 也可由 Laviron’s equation72，73 計算得知，套用下列公式: log𝑘𝑠 = α log(1 − α) + (1 − α)logα − log (. RT ) nFv −α(1 − α). nF∆EP (3 − 9) 2.3RT. 其中α為電化學轉移係數~0.5 , ∆EP =0.0275 V 為 FAD/FADH2 氧化還原對波峰電位差(∆EP = |Ep − E 0 |)，v=0.1 V/s；經計算k s 值為 2.28 s-1，此數值高於其他文獻紀載中之k s 值。. 圖 3- 10 (a) GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在 PBS (pH 7)中不同掃描速率之 CV 圖，從 0.01 V/s 到 1 V/s，掃描範圍從 0 到 0.8 V，(b)掃描速率對反應電流之檢量線。 54.

(67) 3.4.5 薄膜修飾電極利用氧氣消耗以電化學循環伏安法偵測葡萄糖葡萄糖的測定在傳統上是利用酵素催化反應時，監控氧氣的消耗以間接達到電化學偵測，方程式如下: 74 Glucose oxidase. Glucose + O2 →. Gluconic acid + H2 O2. O2 + 4H + + 4e+. 2H2 O2. (3 − 10) (3 − 11). 圖 3-11 顯示各薄膜修飾電極 CV 圖比較，圖 3-11 (a)為薄膜修飾電極 GD/rGO/GOx/Nf 在含有飽和氧氣的 PBS 溶液中以加入不同濃度的葡萄糖進行循環伏安法掃描，施加電壓時，若溶液中充滿氧氣，可在約 -0.4 V 的電位看到氧氣還原鋒，圖中可觀察到在未加入葡萄糖時電流值最大，隨著葡萄糖濃度的增加電流值跟著下降，這顯示出溶液中氧氣的含量逐漸減少；另外我們也實驗了不同修飾條件的電極與 GD/rGO/GOx/Nf 電極做比較，圖 3-11 (b)、(c)、(d)分別為 GD/GOx/Nf、 rGO/GOx/Nf、GOx/Nf，圖中可以觀察到，(d)只有 GOx 修飾在 GCE 上時電流值最小，(c)當增加了 rGO 修飾在電極上時石墨烯幫助了其導電性電流值增加，75 而(b) GOx 在樹狀金電極也因為金的高導電度以及樹枝結構增加了反應表面積，其電流值也有所增加。但此法之準確性易受偵測系統內含氧量的影響而造成訊號不穩，為了改善此問題，我們以非生理物質之電子傳導媒介幫助酵素與電極之間電子傳遞。 55.

(68) 圖 3- 11 (a) GD/rGO/GOx/Nf, (b) GD/GOx/Nf, (c) rGO/GOx/Nf, (d)GOx/Nf 電極在含有飽和氧氣的 0.1 M PBS(pH 7)中依序加入 0.1、 0.3、0.5、0.7、1.0、2.0、3.0、4.0 mM 葡萄糖之 CV 圖，電位範圍 0.3 V 到-0.8 V，掃描速率 50 mV/s。. 3.4.6 薄膜修飾電極利用電子傳導媒介(Mediator)以電化學循環伏安法偵測葡萄糖葡萄糖氧化酶不只可以把電子傳遞給氧，也可以利用電子傳遞媒介物來接受或提供電子之氧化還原反應，以達到增加電子傳遞速度，本研究利用 Ferrocene monocarboxylic acid, FMCA 當作電子傳遞媒介， 56.

(69) 圖 3-12 為本研究葡萄糖偵測反應機制示意圖。. 圖 3- 12 GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極利用 FMCA 當作電子傳導媒介偵測葡萄糖反應機制示意圖。. 圖 3-13 為各薄膜修飾電極在含有 FMCA 的 PBS 中所測得 CV 圖比較，圖 3-13 (a) GD/rGO/GOx/Nf 薄膜修飾電極在含有 0.5 mM 的 0.1 M PBS 溶液中加入不同濃度的葡萄糖進行循環伏安法掃描，在未加入葡萄糖時可以在電位 0.3 V 處看到氧化還原對，此為 FMCA 氧化還原反應。而當陸續加入 0.5、1、2、3、4、5 mM 濃度葡萄糖時，可觀察到氧化波峰隨之增加，還原峰漸漸減弱，且氧化波峰電流值和葡萄糖濃度呈現性關係。此結果證明因為 FMCA 的加入使修飾電極對於催化葡萄糖氧化有更好的幫助，關於葡萄糖傳導媒介反應我們可以下列反應解釋: 74. 57.