2.6.1 藻類生長測定方法概要
水樣經過濾於玻璃纖維濾片後，以乙醇萃取其中之葉綠素 a，再 以分光光度儀測得萃取液在酸化前和酸化後之吸光值，最後依吸光值 計算水樣中葉綠素 a 含量。
2.6.2 適用範圍
本方法適用於一般事業、工廠、都市放流水以及汙水及池塘、河川、
湖泊、水庫及海洋等水中所含葉綠素 α 之急毒性試驗。
2.6.3 干擾
(1) 葉綠素 a 之分解產物，如脫鎂 葉綠素 (Phaeophytins)及脫鎂葉綠甲酯一 酸(Phaeophorbide a)，因其吸收波長與葉綠素 a 相近，會產生干擾，可 利用加酸後扣除吸光值予以校正之。
(2) 測試使用之器皿有不乾淨時，會造成結果上的誤差。
(3) 浮游植物內之其他色素，如葉綠素 b
、
c 含量高時會產生干擾。33
(4) 樣品具濁度時會產生干擾。
2.6.4 基礎培養液
用於藻類培養急毒性測試之基礎培養液，其 pH 值須控制在 7.00~7.40，
其組成如下：
藥品名稱：NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MgCl2、CaCl2·2H2O、NaHCO3， 以上為 Fe-EDTA 溶液(註 1)。H3BO3、MnCl2、CoCl2、CuCl2(註 2)、Na2MoO4、 ZnCl2。
(藥品均購自於友和貿易股份有限公司)
(註 1) Fe-EDTA 溶液單獨滅菌，再與其它培養液混合。
(註 2) 微量元素(H3BO3、MnCl2、CoCl2、CuCl2、Na2MoO4、ZnCl2)需做二 次稀釋以減少誤差，故需取 1000 倍表列克數配製(全部配成一升)後再加以 稀釋。
2.6.5 供試藻類
採用綠藻類單細胞小球藻(Chlorella vulgaris Beij.)，品系編號＃3001，
供試藻類培養如下：
(1)將藻細胞於基礎培養液中，然後在與毒性測試相同之培養條件下培養三 天以上，進行馴養活化。馴化時間之光照採光暗比為 14:10 小時。
(2)未進行試驗之種藻培養液須定日進行稀釋，使小球藻培養液之葉綠素 a
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濃度維持於 1.00~10.0 ppb 之間，以保持藻細胞於對數生長期。
2.6.6 連續性藻類培養方式(Continuous culture technique)
連續式培養系統包括連續供應新鮮的基質到反應槽中，使藻類處於最 佳生長的狀況，並連續將槽中新陳代謝物質排出槽外。此系統相當類似於 自然水體，因低濃度的營養鹽不斷的注入基質中，而所加入的營養鹽與藻 類生長產生一動力平衡。
2.6.7 水樣急毒性測試步驟
1. 利用微量吸管由水耕液中抽取 100μL 等待自然風乾後，添加 1000μL 小球藻液加入 24 孔盤中(抽取時盡量同位置)，並保留 3 孔只添加 100%
小球藻液作為對照組，最後將 24 孔盤放置迴旋震盪儀 24 小時並予光 照。
2. 將 Well 中之待測物質與小球藻原液以 Pipet 吸出放入離心管中，並放 入離心機以 3500 轉以上離心 15 分鐘，由離心管底部可看到綠色小球 藻沉澱，將上清液倒出，倒入 90%酒精 10mL。
3. 放入恆溫水槽中加熱 30 分鐘。
4. 將離心管取出至冰水中急速冷卻，冷卻至管壁變涼。
5. 離心管管壁變涼後，再將離心管放入離心機離心 15 分鐘。
6. 此時開始調校分光質譜儀歸零動作，先用分光質譜儀專用之 5 公分光
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徑之測光管加入 10mL 的 90%酒精，用分光質譜儀測其在波長 665 及 750 nm 之吸光值，分別為 E665a 和 E750a，重複歸零三次。
7. 取出玻璃盒倒掉 10mL 的 90%酒精，並用 RO 水清洗測光管，擦拭乾 淨。
8. 小心取出離心管，避免震動，把待測物倒入測光管中，用分光質譜儀 測其在波長 665 及 750 nm 之吸光值，分別為 E665a 與 E750a。
9. 添加 0.01mL HCl 溶液於 5cm 光徑之測光管中，搖混 1 分鐘後靜置，5~30 分鐘內重新測量其在 665 及 750nm 之吸光值，此分別為 E665b和 E750b。
2.6.8 空白分析值
每一批樣品須以一片不含葉綠素 a 之玻璃纖維濾片，依上述步驟，與 樣品同時做空白分析，並在波長 665 及 750 nm 測定其吸光值；樣品在 波長 665 及 750 nm 之吸光值均須分別扣除此空白分析值才是實際之吸 光值。
2.6.9 結果換算
濁度校正：樣品在 665 nm 之吸光值扣除在 750 nm 之吸光值即為校正後之吸光 值：
校正後的吸光值 C665a ＝ E665a - E750a
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校正後的吸光值 C665b ＝ E665b - E750b 水耕液之葉綠素 α 濃度：
經濁度校正後，用下列公式計算水樣之葉綠素 α 濃度(Ca，μg/L)。
Ca ＝29.62 (C665a - C665b ) × Ve / 5 Vs Ve：乙醇體積(ml)
Vs：水耕液體積(L)