第二章 文獻回顧與實驗簡介
2.7 溶菌酶酵素結構分析
蛋白質是生物體內維持各種機能之重要分子，而蛋白質的功能決 定於它的結構。生物巨分子（包含DNA、RNA 和蛋白質）的三維結 構，已漸漸成為在分子層次上了解各種生命現象所不可或缺的要素。
在蛋白質結構當中個別蛋白質的研究並非一項新的研究領域，化學家 及生物學家不斷的追求有關蛋白質的更多知識，以及瞭解它們如何相 互聯合或與其它的分子聯合而在細胞中運作，這是因為它們的結合將 會影響其結構，而在蛋白質結構上一點點的變化，就會對其功能有決 定性的影響，因此要掌握其結構狀況，就必須擁有“目睹”的能力。過 去以來，用於確定蛋白質結構的方法可分為三類：（1）圓二色旋光 光譜儀（CD）；（2）結晶-X射線繞射（x-ray crystallography）；（3）
核磁共振（nucleic magnetic resonance；NMR）。本實驗將透過這三 種方法分別觀察溶菌酶酵素結構。
2.7.1 圓二色光譜儀測量原理
圓二色光譜儀（CD）主要是利用一個偏極光（polarizedlight）通
過 具 有 旋 光 性 的 物 質 ， 而 此 偏 極 光 又 可 分 成 右 旋 偏 極 光 （right circularly polarized light）及左旋偏極光（ left circularly polarized light），當它們同時通過不具有旋光性的物質時，左右旋偏極光的前
α-helix、β-sheet和 random coil等二級結構分別會在遠紫外光-圓二極
光呈現特有之圖形及光譜強度，α-helix會在波長202及222nm有最大的 負訊號，β-sheet特徵訊號則是在波長218nm的地方有最大負訊號，而 random coil則是在波長197nm有一個最大的負特徵訊號。藉由此原 理，我們首先利用圓二色光譜儀，初步測試不同濃度、不同粒徑之金 奈米粒子對溶菌酶二級結構的影響。
2.7.2 核磁共振分析原理
在核磁共振技術發明之前，X-ray晶體學是唯一能解出分子在三度 空間中立體結構的方法。
1924年物理學家鮑利（Wolfgang Pauli）提出：物質中的原子核，
在某些狀況下，會以角動量運動，即自旋的方式，而變得有磁性。核
旋，在收集自由感應衰減訊號（FID），並利用傅立葉轉換（Fourier transform）和多次累加，成功的提高靈敏度。到了1976年，Jeener成
功實驗出二維圖譜技術後，使核磁共振光譜解析度大為提升，成為分 析生物巨分子的工具之一。
在蛋白質結構的研究中，最常使用的方法為X光繞射和核磁共振 光譜分析，二者最大的不同處在於X光繞射法必須先將蛋白質結成晶 體後，才能進行結構上的分析，而以核磁共振光譜則可測得在溶液環 境下分子的結構。蛋白質存在生物體中，主要都是在溶液環境下發揮 作用，且結構通常具有相當大的彈性，有時形成結晶後已與先前活化 狀態的型態不同，由X光繞射法所得到的結構，並非都可正確的表現 出蛋白質於活性狀態下的構形，因此用核磁共振光譜法對蛋白質結構 的研究帶來很大的幫助。
2.7.3 X 光繞射及晶體結構分析原理
最常用來確定蛋白質立體空間結構的方法為X光繞射法，首先利 用各種結晶的方法長出蛋白質晶體後，再以X光繞射收集繞射數據，
並加以分析以解出其結構。利用同步輻射X光光源之高解析繞射分析 金奈米粒子-溶菌酶之立體結構，因為其光源光子密度大、準直性佳、
且強度為一般X光光管強10~105倍，因此能得到高解析度的繞射圖 譜，進而對溶菌酶結構做詳細的分析。
在數據處理方面，首先先對繞射圖譜處理，我們利用軟體計算每 個繞射點的強度並做積分，刪除不理想的繞射數據，並做檔案轉換。
之後再利用軟體以PDB（RCSB PDB， RCSB Protein Data Bank）上 一般溶菌酶結構建立模型，根據繞射圖譜解析所得的電子密度做計 算，再作結構精調，使胺基酸側鏈能夠符合電子密度，以得到理想的 R值。最後再比較加入金奈米粒子前後溶菌酶的結構，以分析其差異。