3.4 實驗方法
3.4.3 滲透壓測量
取一定體積(20μl)之 MEM 培養基、高葡萄糖培養基及山梨醇培養基滴至濾 紙上，將濾紙放入滲透壓分析儀測量各培養基滲透壓。
3.4.4 細胞比生長速率(specific growth rate)計算
批式培養細胞時，對數生長期的細胞數會隨著時間成對數增加，以下列公式 表示細胞生長速率(單位時間細胞數量變化)
rn = dx/dt --- (1)
rn：細胞生長速率 x：細胞濃度 t：時間
比生長速率(μ)為一個細胞的平均生長速率 μ= rn/x
μx = dx/dt --- (2)
對(2)式兩邊積分
∫tt0 μdx = ∫xx0 dx/x --- (3) t0：起始時間
x0：時間t0時之細胞濃度
整理(3)可得
μ(t - t0) = ln (dx/x0)
μ= (1/dt)× ln (dx/x0) --- (4) dt = t - t0
由（4）式可得到μ值(細胞比生長速率)
3.4.5 細胞蛋白質萃取
培養皿置於冰上，在冰上移除培養基，以 4℃ PBS 清洗培養基後，加入 80 μl RIPA buffer，用細胞刮刀(scraper)刮下細胞後移至 1.5 ml 微量離心管。用針筒 抽取將細胞膜打破，在 4℃，13000 rpm 離心 20 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 微 量離心管，放到 -80℃ 冰箱保存。
3.4.6 蛋白質濃度測定
蛋白質標準曲線測定
利用Bradford於 1976 年發表蛋白質定量之原理，利用Coomassie Brilliant Blue
G-250 與蛋白質結合的特性，G-250 與蛋白質結合後顏色由紅色轉變成藍色，此 偵測 595 nm波長(OD595)之吸收。此方法優點為靈敏，可偵測到ng蛋白質量，G-250 與蛋白質結合反應所需的時間短(約 2 分鐘)，G-250-蛋白質複合物(complex)在溶 液中可維持長約 1 小時的時間。
以Bio-Rad protein assay kit進行蛋白質濃度測定。取 1.35 mg/ml bovine serum
albumin (BSA)作為標準液，用二次水稀釋 10 倍，依 10、20、40、60、80、100 μl體積取至微量離心管，分別加入 790、780、760、740、720、700 μl二次水，
再加入 200 μl protein assay dye，使其總體積為 1000 μl。以分光光度計
(spectrophotometer) 測量不同濃度BSA標準液的OD595吸光值，作出濃度與吸光值 關係的曲線及公式。
樣品蛋白濃度測定
取 5 μl細胞蛋白質萃取液加入含有 200 μl 染劑及 795 μl二次水的微量離
心管中，測量蛋白質液OD595吸光值，將吸光值帶入公式中，換算出細胞萃取液
蛋白質濃度。
3.4.7 蛋白質凝膠電泳法
配製下層 12% resolving gel，室溫靜置 1 小時，膠凝後再配置上層 5% stacking gel，室溫靜置 30 分鐘，膠凝固後移至 SDS 電泳槽，加入 SDS-PAGE running buffer。取 40 μl 細胞萃取液與 10 μl 5X SDS loading dye 混勻，於 100℃ 水 中加熱 5 分鐘，再置於冰上。依定量結果，取 marker 與等量濃度(50μg)蛋白
loading，以 80 伏特電壓進行電泳 5 小時。
3.4.8 西方墨點法
預先浸泡 PVDF membrane 於甲醇 15 分鐘，再移至 transfer buffer 浸泡 15 分 鐘，預先浸泡 3M filter paper 於 transfer buffer 15 分鐘。電泳完成後，取下電泳膠，
依 3M filter paper、gel、PVDF membrane、3M filter paper 負極至正極次序裝置到
gel holder cassette 中，放入轉漬電泳槽，以 200 毫安培電流 4℃進行轉漬 2.5 小時。
完成後取出 PVDF membrane，帶有蛋白的面朝上放入盒裡，加入 blocking solution，於室溫搖晃 1 小時，以 PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，再加入一級抗體 (1:1000)，4℃搖晃隔夜，PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，接著加入二級抗體(1:1000)，
室溫搖晃 1 小時，PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘。清洗完畢，加入 ECL 溶液作用
1 分鐘，把 PVDF membrane 放到壓片裝置中，以 Kodak 底片進行適度時間壓片，
觀察實驗結果。以 Zero-Dscan 軟體將底片上 band 選取定量，計算 band intensity，
將蛋白表現數值化。
3.4.9 免疫螢光染色法
懸浮細胞染色法
取 1×105/ml CHO β-gal SF cell 於培養皿，分別加入 30 ppm 或 100 ppm ATA 培養 3 天，收取細胞至 15 ml 離心管，1000 rpm離心 5 分鐘，移除上清液，以PBS 清洗 2 次，加入 1 ml 4% paraformalhyde固定細胞，並於 4℃隔夜，PBS清洗後加
入 1 ml 5% acetic acid/95% ethanol，於-20℃將細胞膜打洞 1 小時，PBS清洗 2 次，
加入 5% FBS/PBS blocking 30 分鐘，再加入cadherin 或integrin β1 抗體 (1:100)於
4℃作用 5 小時後，PBS 清洗 2 次，加入TRITC-conjugated 二級抗體(1:800)於 37℃
反應 1 小時，PBS 清洗 2 次，取細胞至載玻片上，以共軛焦顯微鏡觀察染色情形，
並以Fluoview程式進行螢光染色定量分析。
貼附細胞染色法
將蓋玻片放置培養皿內，以 0.1% gelatin solution於 37℃ coating 1 小時，移 除gelatin solution，待蓋玻片變乾後，取 1×105/ml CHO β-gal SF cell 於培養皿，
加入 30 ppm ATA培養 3 天。進行染色前，移除培養基，以PBS清洗 2 次，加入 1 ml 4% paraformalhyde固定細胞，並於 4℃隔夜，PBS清洗後加入 1 ml 5% acetic acid/95% ethanol，於-20℃將細胞膜打洞 15 分鐘，PBS清洗 2 次，加入 5% FBS/PBS blocking 30 分鐘，再加入cadherin 或integrin β1 抗體 (1:100)於 4℃作用 5 小時
後，PBS 清洗 2 次，加入TRITC-conjugated 二級抗體(1:800)於 37℃反應 1 小時，
PBS 清洗 2 次，取出蓋玻片放至載玻片上，以共軛焦顯微鏡觀察染色情形，並以 Fluoview程式進行螢光染色定量分析。
肆. 結果
4.1 培養基滲透壓與CHO K1 cell生長關係
為了解高葡萄糖造成之滲透壓是否影響 CHO K1 cell 生長，在含有 10% 血清
MEM 培養基中分別添加 9 g/L 葡萄糖或 9 g/L 山梨醇以提高培養基滲透壓。由於 山梨醇為一相似葡萄糖結構之分子(如附圖五)，細胞無法代謝利用山梨醇，在
MEM 培養基添加 9 g/L 山梨醇做為高滲透壓環境之調節。細胞培養於 MEM 培養 基、高葡萄糖培養基及山梨醇培養基，分別在第 15 小時、30 小時、45 小時測量 培養基滲透壓，並計算個別之細胞濃度。
隨著培養時間延長，發現高葡萄糖培養基滲透壓和山梨醇培養基滲透壓在第 15 小時、30 小時及 45 小時後，仍維持在高滲透壓狀態(350 mosmol/kg 以上)，
MEM 培養基維持在低滲透壓(330 mosmol/kg) (圖一)。計算細胞比生長速率，以 代表細胞的生長速度，比生長速率高，表示細胞生長快，比較細胞生長情形發現
(圖二 A 與 B)，MEM 培養基之細胞生長速率最快，比生長速率為 1.36 ± 0.06 / 天。高葡萄糖培養基次之，比生長速率為 1.22 ± 0.11 /天，山梨醇培養基最慢，
比生長速率為 1.18 ± 0.04 /天，統計結果山梨醇培養基生長速率 P value 小於 0.05，有顯著差異，高滲透壓環境下，細胞生長比較慢，顯示培養基之滲透壓會
影響細胞生長速率。
4.2 滲透壓對 CHO K1 cell p38 MAPK 之影響
過去研究發現培養環境中滲透壓升高時， MAPK families 中的 p38 MAPK 會 受到滲透壓影響，進而調控基因表現與細胞生理[Igarashi et al., 1998]，我們分析 不同滲透壓培養基(MEM 培養基、高葡萄糖培養基及山梨醇培養基)對於 CHO K1
cell p38 MAPK 蛋白質活化之影響，以西方墨點法分別比較第 1、15 及 30 小時細 胞內 p38 MAPK 活性(圖三 A)，利用 ZERO-Dscan 程式分析底片結果，將磷酸化
p38 MAPK 與未磷酸化 p38 MAPK 表現量數值化，並將磷酸化 p38 MAPK 與未磷 酸化 p38 MAPK 作一相對比較(圖三 B)。相較於 MEM 培養基，結果顯示在培養 第 1 小時，高葡萄糖培養基和山梨醇培養基之 p38 MAPK 有活化，第 15 與 30 小 時，不同滲透壓培養基之 p38 MAPK 活化並無明顯改變。
4.3 滲透壓對 CHO K1 cell p42 MAPK 之影響
實驗室先前研究發現提高培養基葡萄糖含量時，會引起 p42 MAPK (ERK2)
磷酸化，其他研究亦顯示高滲透壓環境會促進 p42 MAPK 活化[Nagata et al.,
1999]，因此，我們進一步探討不同滲透壓培養基 (MEM 培養基、高葡萄糖培養 基及山梨醇培養基)對細胞 p42 MAPK 蛋白質活化的影響，以西方墨點法分別比 較第 1、15 及 30 小時細胞內 p42 MAPK 活性(圖四 A)，利用 ZERO-Dscan 程式分 析底片結果，將磷酸化 p42 MAPK 與未磷酸化 p42 MAPK 表現量數值化，並將磷 酸化 p42 MAPK 與未磷酸化 p42 MAPK 作一相對比較(圖四 B)。結果顯示高葡萄 糖培養基和山梨醇培養基在第 1、15 及 30 小時，皆會引起 p42 MAPK 蛋白活化。
高葡萄糖培養基和山梨醇培養基之 p42 MAPK 第 1 小時活化程度較 MEM 培養基
p42 MAPK 活化高 3 倍，第 15 小時比 MEM 培養基 p42 MAPK 活化高 2 倍。此 外，在第 30 小時，相較於 MEM 與高葡萄糖培養基，山梨醇培養基可活化 p42 MAPK 達 2 倍。結果顯示高滲透壓培養基會活化 p42 MAPK。
4.4 ATA 濃度與 CHO β-gal SF cell 生長關係
研究顯示 DMSO [Fiore et al., 1999]與 ATA [Andrew et al., 1999]都有促進細胞 增生功用。DMSO 為 ATA 的溶劑，因此在探討 ATA 對於 CHO β-gal SF cell 的 影響，於 DMEM/F12 培養基中添加 30 ppm DMSO 作為對照組，及分別添加 30 ppm ATA 或 100 ppm ATA 比較 CHO β-gal SF cell 生長情形(圖五 A)。結果顯示
DMEM/F12 培養基比生長速率為 0.81 ± 0.01 /天，加入 30 ppm DMSO 培養基細胞 比生長速率為 0.95 ± 0.01 /天，添加 30 ppm ATA 培養基細胞比生長速率為 1.02 ±
0.15 /天，100 ppm ATA 培養基細胞比生長速率為 0.74 ± 0.09 /天(圖五 B)。結果發 現添加 30 ppm DMSO 與 30 ppm ATA 培養基都會促進細胞生長，而 100 ppm 高濃 度 ATA 細胞生長速率較 DMEM/F12 培養基細胞生長速率低，顯示高濃度 ATA 不 會促進細胞生長。
4.5 ATA 濃度對細胞型態(adhesion 與 aggregation)之影響
過去研究發現無血清狀態培養 CHO β-gal SF cell 時，加入低濃度 ATA(15
ppm)引起部分懸浮培養的 CHO β-gal SF cell 貼附到培養皿。高濃度 ATA(50 ppm) 影響懸浮聚集 CHOβ-gal SF cell 的狀態，造成細胞懸浮不聚集的現象[Liu et al., 2001a]。為了解 ATA 對細胞型態造成之影響，我們利用懸浮聚集 CHO β-gal SF cell 來觀察，control 組(沒有添加 DMSO 與 ATA)，細胞為懸浮聚集成葡萄串狀(圖 六 A)，添加 30 ppm DMSO，細胞仍為懸浮聚集狀態(圖六 B)，當添加 30 ppm ATA 培養時，部分細胞由懸浮聚集狀態貼附到培養皿上成梭狀(圖六 C)，加入 100 ppm ATA 培養時，細胞由懸浮聚集改變成懸浮不聚集狀態(圖六 D)，因此不同濃度 ATA 培養基會對細胞型態造成改變。
4.6 ATA 濃度對 CHO β-gal SF cell cadherin 表現影響
由於 ATA 無法穿透細胞膜，因此在探討 ATA 造成細胞型態改變時，以偵測 與調控細胞型態有關的細胞膜蛋白表現，了解 ATA 影響細胞型態改變之機制。
Cadherins 為 transmembrane glycoproteins，以 homo-type 方式與相鄰細胞 cadherin 連結形成附著分子，讓細胞與細胞之間 aggregation [Koch et al., 2004]。
我們以免疫螢光染色方法偵測細胞膜蛋白質 cadherin 表現情形，圖七 a、d、
g、j、m、p 為 confocal 顯微鏡可見光照相結果，b、e、h、k、n、q 為螢光染色 結果，c、f、i、l、o、r 為可見光與螢光染色重疊結果。結果顯示未添加 ATA 與 添加 30 ppm ATA 及添加 100 ppm ATA 時，CHO β-gal SF cell cadherin 皆有表現 (圖七 c、h、k、n、q)。
以 Fluoview 軟體對於細胞螢光染色結果定量，將 cadherin 表現強度數值化，
發現 control 組(DMEM/F12 培養基中未添加 DMSO 或 ATA) ，懸浮聚集細胞
cadherin 表現量強度為＂1011 ± 54＂(圖七 e)；添加 DMSO，懸浮聚集細胞 cadherin 表現量強度為＂917 ± 36＂(圖七 h)；添加 30 ppm ATA，懸浮聚集細胞 cadherin 表 現量強度為＂879 ± 170＂(圖七 k)，貼附細胞 cadherin 表現量強度為＂602 ± 160
＂(圖七 n)；添加 100 ppm ATA，懸浮不聚集細胞 cadherin 表現量強度為＂954 ± 28
＂(圖七 q)；定量結果顯示不同 ATA 濃度不影響 cadherin 表現。
4.7 ATA 濃度對 CHO β-gal SF cell integrin β1 表現影響
Integrins 為 transmembrane proteins，由α和β兩種 subunits 組成，以 hetero-type 方式和細胞膜上其他細胞附著的分子(extra cellular molecule)結合，與細胞貼附有 關[Rosenberger et al., 2004]，藉由偵測 integrin β1 表現了解 ATA 對細胞型態改變 之影響。
Integrin β1 是 CHO cell 表現最多的 integrin subunit，以免疫螢光染色方法偵 測 CHO β-gal SF cell integrin β1 表現，圖八 a、d、g、j、m 為 confocal 顯微鏡 可見光照相結果，b、e、h、k、n 為螢光染色結果，c、f、i、l、o 為可見光與螢 光染色重疊結果。發現 control 組，懸浮聚集細胞不表現 integrin β1 (圖八 b)，添 加 DMSO 亦不引起 integrin β1 表現(圖八 e)，當加入 30 ppm ATA 與 100 ppm ATA，皆會引起 integrin β1 活化(圖八 h、k、n)。
以 Fluoview 軟體對於細胞螢光染色結果定量，將 integrin β1 表現強度數值
以 Fluoview 軟體對於細胞螢光染色結果定量，將 integrin β1 表現強度數值