Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)為絲胺酸/酥胺酸蛋白激活酶 (ser/thr protein kinases)，MAPKs 會受到環境中多種因子如生長因子、荷爾蒙、壓
力影響，藉此調控細胞內基因表現、細胞增生(proliferation)與分化(differentiation) 及細胞凋亡等；當細胞接受外來刺激時，Ras/Rho 家族中 small GTP-binding protein 活化最上游 MAPK kinase kinases (MKKKs)，MKKKs 活化引起下游 MAPK kinases
(MKKs)磷酸化後，MKKs 接著活化下游 MAPKs，MAPKs 進而調控細胞核內基 因表現與反應及活化其他蛋白如：phospholipases、transcription factors、cytoskeletal proteins 。 MAPK 可分成三大類： extracellular signal regulated protein kinases (ERKs)、c-Jun N-terminal kinases (JNKs)及 p38 MAPK。
ERKs family中的ERK1/2 (p44/p42 MAPK)目前研究較為廣泛，當細胞受到生 長因子或血清刺激時，ERK1/2 藉由磷酸化方式活化下游多樣受質(multiple substrates)或引起細胞核內其他轉錄反應，刺激細胞增生、分化及生長。ERK1 和 ERK2 胺基酸序列有 83%相似度，與cell cycle調控有關，cell cycle分為四期：first gap phase (G1), DNA synthesis phase (S), second gap phase (G2), mitosis phase (M)，
ERK1/2 參與G1 phase至S phase和G2 phase至M phases之調控[Hulleman et al., 1999;
Pages et al., 1993; Roux et al., 2004] 。
JNKs 和 p38 MAPK 屬於 stress-activated protein kinases (SAPKs)，會被不同的 環境壓力活化，如：熱休克(heat shock)、滲透壓(osmotic stress)、pro-inflammatory cytokines、離子化放射線(ionizing radiation)及 ultraviolet (UV) radiation 等。JNKs
主要會受 cytokines、UV radiation 及 DNA-damage agents 活化，JNKs 活化後形成 雙體結構，從細胞質通過核膜轉位(translocate)到細胞核內，並活化下游 activator protein-1 (AP-1)或 nuclear transcription factors (NTF) ，如：activating transcription factor-2 (ATF-2)、Myc、p53、MAP-kinase activating death domain-containing protein (MADD) 等 ， 引 起 細 胞 凋 亡 或 發 炎 反 應 (inflammation) 或 癌 症 生 成 (tumourigenesis)。p38 MAPK 主要被環境中的滲透壓、熱休克、氧化壓力(oxidative stresses)等活化，p38 MAPK 活化下游 ATF-2、heat shock protein (HSP)、cAMP regulatory element binding protein (CREB)等蛋白，調控細胞 motility、或染色體結 構(chromatin remodeling)，使細胞啟動修復機制或進行 cell cycle arrest 或細胞凋亡 [de Nadal et al., 2002; Johnson et al., 2002; Roux et al., 2004] 。
MAPK families 有其獨立訊息傳遞途徑，彼此之間亦有 cross talk 的現象，受 到訊息刺激時間、刺激強度、細胞種類、受器種類等影響，訊息作用程度也不相 同，如滲透壓引起 MKKKs 中 mitogen-activated protein/ERK kinase kinases (MEKKs) 和 mixed linage kinases (MLKs) 及其下游 MKKs 活化。MKKs 分別活化下游之
MAPKs，其中 MEK1 和 MEK2 活化 ERKs，MKK3 和 MKK6 會活化 p38 MAPK，
而 JNKs 可被 MKK4 和 MKK7 活化。 ERKs、p38 MAPK 及 JNKs 活化又分別影 響其下游基因表現，調控細胞生理反應。如附圖二所示[Cowan et al., 2003; Kultz et al., 1998b] 。
2.5 高滲透壓環境(hyperosmotic stress) 與 p38 MAPK 關係
以酵母菌為例，滲透壓影響細胞內多種訊 息傳遞途徑，細胞骨架重組 (cytoskeletal reorganization)、細胞壁 dynamics 改變、影響細胞內代謝(metabolic adjustments)及 cell cycle arrest 等，目前以 MAPK high osmolarity glycerol 1 (HOG1) 訊息途徑之研究較為詳盡，HOG1 為 SAPK，可受到 cAMP-activated protein kinase (PKA)活化後，調控下游基因表現來因應高滲透壓環境，使酵母菌可以生存[de Nadal et al., 2002]。
研究發現高濃度葡萄糖造成之高滲透壓環境會影響哺乳動物細胞 MAPK 訊 息調控，如 17 mM 葡萄糖濃度引起 pancreatic β-cell DNA 片段化與細胞凋亡現 象[Efanova et al., 1998]，22 mM 葡萄糖濃度造成 osteoblast p38 MAPK 與 ERK1/2
(p44/p42)活化；在不同細胞內，高滲透壓使 p38 MAPK 快速磷酸化、JNK 磷酸化 時間延長、ERK 活化。目前滲透壓活化 ERK 機制仍有待探討，p38 MAPK 會活 化下游 ATF-2，進而影響細胞核內的轉錄作用，導致細胞週期停滯或細胞凋亡 [Galvez et al., 2003; Kultz et al., 1998a; Li et al., 2001; Nagata et al., 1999; Zayzafoon et al., 2002] 。
2.6 Aurintricarboxylic acid (ATA)對動物細胞影響
Aurintricarboxylic acid (ATA)於 1892 年首先被合成出來，其分子量為 442 Da，ATA為一triphenylmethane 紅色染劑，可溶於dimethylsulfoxide (DMSO)，其 結構如附圖三所示，研究發現ATA對細胞毒性低(LD50：9 g/kg, oral in rat) ，且無 法穿透細胞膜，經由與細胞膜上受器作用而影響到細胞內的訊息傳遞與細胞生 理。醫學研究顯示：ATA可抑制nuclease [Glasspool-Malone et al., 2002]與
topoisomerase II [Benchokroun et al., 1995]活性，促進細胞增生[Andrew et al., 1999]
和抑制細胞凋亡 [Cho et al., 2004] ，也會抑制血小板聚集 [Waissbluth et al., 2002] ；近來研究亦發現ATA對病毒也有抑制作用，如抑制HIV [Cushman et al., 1992] 和SARS virus [He et al., 2004] 活性。
2.7 ATA 與無血清培養基之開發
在培養哺乳動物細胞製程方面，由於體外培養細胞通常會加入 5-20%動物血 清，血清具有營養與緩衝的功能，可促進細胞生長，但血清可能造成下列問題：
1. 血清批次間品質不易控制，可能帶有不確定的感染物質，如傳染疾病的狂牛病 普恩蛋白(prion)或病毒；2. 血清價格昂貴，增加培養細胞的成本；3. 干擾下游蛋 白質回收與純化。為了降低血清培養基成本和減少可能之污染及易於回收純化蛋
白，許多藥廠積極開發無血清培養基，其中ATA也有相關研究，ATA可被用來取 代transferrin，促進Fe2+運輸 [Bertheusseen, 1991]，ATA對於無血清培養CHO cell 有類似insulin促進細胞生長之功能 [Liu et al., 2001a]。
目前在黃效民博士研究中發現無血清狀態培養 CHO β-gal SF cell (CHO β-gal serum free ) cell 時，低濃度 ATA (15 ppm)會引起 CHO β-gal SF cell 增生，
並使得原本部分懸浮 CHO β-gal SF cell 產生形態(morphology)改變，貼附到培養 皿上。高濃度 ATA (50 ppm)雖無明顯促進 CHO β-gal SF cell 增生現象，但會影 響 CHO β-gal SF cell 間細胞交互作用(cell-cell interaction)，造成細胞由聚集
(aggregation)變成不聚集(non-aggregation)狀態 [Liu et al., 2001a]，此現象是本實驗 探討目標之ㄧ。
2.8 細胞貼附(adhesion)與細胞聚集(aggregation)
目 前 已 知 細 胞 膜 上 cadherins 與 細 胞 aggregation 有 關 。 Cadherins 為 Ca2+-dependent transmembrane glycoproteins，由一extracellular domain與高重複性 cytoplasmic domain組成。細胞與細胞之間aggregation作用透過extracellular domain 與相鄰細胞 extracellular domain以homo-type方式連結形成附著分子，[Koch et al.,
2004]；cytoplasmic domain與catenin [Wheelock et al., 2003]或actin cytoskeleton [Yap et al., 2003]結合(如附圖四)，調控細胞與細胞間交互作用及cytoskeletal networks 之訊息途徑，影響細胞生長、分化及轉型(transformation)。
Integrins 是細胞貼附(adhesion)最主要的細胞膜表面蛋白質，adhesion 是細胞 貼附到細胞以外之基質(extra-cellular matrix)。Integrins 為細胞 adhesion receptors，
由α和β兩種 subunits 組成之 transmembrane proteins，目前發現 16 種αsubunits 和 8 種βsubunits 組成達 22 種 integrins (如附表一) [Kreis et al., 1999]。Integrins 以 hetero-type 方式和細胞膜上其他細胞附著分子(extra cellular molecule, ECM)結 合，讓細胞貼附到基質上[Rosenberger et al., 2004]，調控與 integrin-dependent adhesion 有關之生長、分化及基因表現等之生理。
參. 材料、設備及方法
3.1 實驗材料
3.1.1 細胞株
中國倉鼠卵巢細胞株由食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC) 黃 效 民 博 士 提 供 ， CHO (Chinese hamster ovary) K1 cell BCRC 編號為 60006，CHO β-gal SF (serum free ) cell BCRC 編號為 60377 [Liu et al., 2001b]。
3.1.2 藥品試劑
ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham pharmacia ECL Plus Western Blotting Detection Reagents Amersham pharmacia PVDF membrane Amersham pharmacia 30% Acryamide/Bis Solution Bio-Rad
Ammonium persulfate Bio-Rad
Protein assay dye Bio-Rad TEMED Bio-Rad 10X Cell lysis buffer Cell Signaling Biotinylated protein ladder detection pack Cell Signaling phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) antibody
#9211 Goat anti mouse IgG HRP conjugated polyclonal
antibody
Chemicon
Goat anti rabbit IgG HRP conjugated polyclonal antibody
Sodium bicarbonate GIBCO Trypsin-EDTA GIBCO Trypan blue stain GIBCO Kodak Biomax MR film Kodak Acetic acid Merck Ethanol Merck
Methanol Merck
Cadherin antibody sc-10733 Santa Cruz Integrin β1 antibody sc-8978 Santa Cruz Aurintricarboxylic acid (ATA) Sigma
Gelatin Sigma
Lino-acid BSA Sigma Meat peptone Sigma Paraformalhyde Sigma SITE Sigma TRITC-conjugated 2° antibody Sigma
3.1.3 藥品配方
Cell lysis buffer (RIPA buffer)
Tris-HCl，pH 7.5 20 mM NaCl 150 mM
Triton X-100 1%
Sodiumdesoxycholate 1%
Sodium dodecylsulfate (SDS) 0.1%
Ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) 1 mM Sodium fluoride (NaF) 100 mM Benzamidine 1 mM Phenylmethane sulphonylfluoride (PMSF) 1 mM Sodium orthovanadate (Na3VO4) 1 mM
SDS-PAGE running buffer
Tris-base 5 mM Glycine 50 mM SDS 0.01%
5X SDS loading dye
Tris-HCl 300 mM SDS 10%
Bromophenol blue 0.13%
Glycerol 50%
2-merecaptoethanol 25%
12% resolving gel
Acrylamide 12%
Tris（pH 8.8） 375 mM SDS 0.1%
Ammonium persulfate 0.1%
TEMED 0.04%
5% stacking gel
Acrylamide 5%
Tris（pH 6.8） 125 mM SDS 0.1%
Ammonium persulfate 0.1%
TEMED 0.1%
1X PBS pH 7.4
NaCl 137 mM Na2HPO4 10 mM KCl 2.7 mM KH2PO4 1.8 mM
Transfer buffer
Glycine 39 mM Tris base 48 mM SDS 0.04%
Methonal 20%
Blocking solution
Skim milk 5%
Tween 20 0.02%
in PBS
3.2 實驗設備
二氧化碳細胞培養箱 Nuarie
倒立顯微鏡 Leica
分光光度計(Spectrophotometer) Perkin elmer
蛋白質電泳槽 (Hofer SE 520 mighty small mini-vertical unit) Amersham pharmacia
轉漬電泳槽 (Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell) Bio-Rad
共軛焦顯微鏡 (Confocal microscopy) Olympus
滲透壓分析儀(Osmometer) Wescor
3.3 實驗分析軟體
Zero-Dscan Version 1.1 Scanalytics Fluoview FV500 Version 4.3 Olympus
3.4 實驗方法
3.4.1 細胞培養
CHO K1 cell 培養於添加 10% FBS 與 0.22% 碳酸氫鈉之 MEM 培養基，置於
37℃、5% 二氧化碳及飽和濕度恆溫培養箱。當細胞佈滿培養皿時，以 37℃ PBS 清洗後，trypsin-EDTA 處理約 1~2 分鐘，加入 MEM 培養基將聚集細胞打散，以 適當比例分盤繼代培養。
CHO β-gal SF cell 培養於添加 0.15% 碳酸氫鈉、0.25% SITE、0.24% Meat
peptone、0.09% lino-acid BSA 之 D-MEM/F-12 培養基，置於 37℃、5% 二氧化碳 及飽和濕度培養箱。繼代培養時，收集細胞至 15 ml 離心管，以 pipet 將聚集細 胞打散，以 1/5 比例 4 天繼代培養一次。
3.4.2 高低滲透壓處理
取 1×106 CHO K1 cell至 10 cm培養皿，待細胞貼附，將培養基換成添加 9 g/L 葡萄糖或 9 g/L山梨醇之高滲透壓培養基處理，分別於處理 1 小時、15 小時及 30
小時，萃取細胞蛋白質。
3.4.3 滲透壓測量
取一定體積(20μl)之 MEM 培養基、高葡萄糖培養基及山梨醇培養基滴至濾 紙上，將濾紙放入滲透壓分析儀測量各培養基滲透壓。
3.4.4 細胞比生長速率(specific growth rate)計算
批式培養細胞時，對數生長期的細胞數會隨著時間成對數增加，以下列公式 表示細胞生長速率(單位時間細胞數量變化)
rn = dx/dt --- (1)
rn：細胞生長速率 x：細胞濃度 t：時間
比生長速率(μ)為一個細胞的平均生長速率 μ= rn/x
μx = dx/dt --- (2)
對(2)式兩邊積分
∫tt0 μdx = ∫xx0 dx/x --- (3) t0：起始時間
x0：時間t0時之細胞濃度
整理(3)可得
μ(t - t0) = ln (dx/x0)
μ= (1/dt)× ln (dx/x0) --- (4) dt = t - t0
由（4）式可得到μ值(細胞比生長速率)
3.4.5 細胞蛋白質萃取
培養皿置於冰上，在冰上移除培養基，以 4℃ PBS 清洗培養基後，加入 80 μl RIPA buffer，用細胞刮刀(scraper)刮下細胞後移至 1.5 ml 微量離心管。用針筒 抽取將細胞膜打破，在 4℃，13000 rpm 離心 20 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 微 量離心管，放到 -80℃ 冰箱保存。
3.4.6 蛋白質濃度測定
蛋白質標準曲線測定
利用Bradford於 1976 年發表蛋白質定量之原理，利用Coomassie Brilliant Blue
G-250 與蛋白質結合的特性，G-250 與蛋白質結合後顏色由紅色轉變成藍色，此 偵測 595 nm波長(OD595)之吸收。此方法優點為靈敏，可偵測到ng蛋白質量，G-250 與蛋白質結合反應所需的時間短(約 2 分鐘)，G-250-蛋白質複合物(complex)在溶 液中可維持長約 1 小時的時間。
以Bio-Rad protein assay kit進行蛋白質濃度測定。取 1.35 mg/ml bovine serum
albumin (BSA)作為標準液，用二次水稀釋 10 倍，依 10、20、40、60、80、100 μl體積取至微量離心管，分別加入 790、780、760、740、720、700 μl二次水，
再加入 200 μl protein assay dye，使其總體積為 1000 μl。以分光光度計
(spectrophotometer) 測量不同濃度BSA標準液的OD595吸光值，作出濃度與吸光值 關係的曲線及公式。
樣品蛋白濃度測定
取 5 μl細胞蛋白質萃取液加入含有 200 μl 染劑及 795 μl二次水的微量離
心管中，測量蛋白質液OD595吸光值，將吸光值帶入公式中，換算出細胞萃取液
蛋白質濃度。
3.4.7 蛋白質凝膠電泳法
配製下層 12% resolving gel，室溫靜置 1 小時，膠凝後再配置上層 5% stacking gel，室溫靜置 30 分鐘，膠凝固後移至 SDS 電泳槽，加入 SDS-PAGE running buffer。取 40 μl 細胞萃取液與 10 μl 5X SDS loading dye 混勻，於 100℃ 水 中加熱 5 分鐘，再置於冰上。依定量結果，取 marker 與等量濃度(50μg)蛋白
loading，以 80 伏特電壓進行電泳 5 小時。
3.4.8 西方墨點法
預先浸泡 PVDF membrane 於甲醇 15 分鐘，再移至 transfer buffer 浸泡 15 分 鐘，預先浸泡 3M filter paper 於 transfer buffer 15 分鐘。電泳完成後，取下電泳膠，
依 3M filter paper、gel、PVDF membrane、3M filter paper 負極至正極次序裝置到
gel holder cassette 中，放入轉漬電泳槽，以 200 毫安培電流 4℃進行轉漬 2.5 小時。
完成後取出 PVDF membrane，帶有蛋白的面朝上放入盒裡，加入 blocking solution，於室溫搖晃 1 小時，以 PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，再加入一級抗體 (1:1000)，4℃搖晃隔夜，PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘，接著加入二級抗體(1:1000)，
室溫搖晃 1 小時，PBST 清洗 3 次，每次 5 分鐘。清洗完畢，加入 ECL 溶液作用
1 分鐘，把 PVDF membrane 放到壓片裝置中，以 Kodak 底片進行適度時間壓片，
觀察實驗結果。以 Zero-Dscan 軟體將底片上 band 選取定量，計算 band intensity，
觀察實驗結果。以 Zero-Dscan 軟體將底片上 band 選取定量，計算 band intensity，