第四章 結果與討論
七、 無法區別的臺灣品種
SNP 標誌篩選結果，計有‘越光’/‘TN16’、 ‘TT30’/‘TT33’及‘TCSG1’/‘TCSG2’
三組品種間無具有多型性的 SNP。‘越光’為日本品種，米質佳但因其短日照的特 性，於臺灣種植時常因日照時間短照成提早抽穗，產量減低，‘TN16’以‘越光’與
‘臺農 67 號’為親本，取‘越光’之優良米質背景與‘臺農 67 號’對日照鈍感之特性，
將‘臺農 67 號’調控抽穗期相關基因 hd1、Hd6 和 ehd1 導入越光（陳等，2010），
成功育種出與‘越光’優良的米質相當且生育期較長，產量較高的‘臺南 16 號’，其 帶有高度與越光相同的基因背景（陳等，2012）；‘TT33’以‘TT30’為母本，‘basmati 370’為父本，雜交後經過 14 代自交選拔，得到抗稻熱病、株型良好不易倒伏、
米粒外觀優良、米飯食味佳且耐儲藏的‘TT33’（丁等，2013）；‘TCSG2’ 以‘TCSG1’
為母本，‘臺中秈 17 號’與‘臺稉 16 號’的雜交後代為父本，選育出高產、強稈、
不易倒伏、氮肥利用效率高、抗稻熱病、縞葉枯病、斑飛蝨與白背飛蝨，碾米品 質佳但耐寒性較差的‘TCSG2’，其品種特性與‘TCSG1’的同質性高，但產量較
‘TCSG1’較高，且碾米品質較佳（楊，2006）為目前主要推廣的取代‘TCSG1’的 品種。
品種鑑別主要的目的有二，一為保護育種者智慧財產權，一為監控農產品產 銷和品質等（林，2005），本次套件無法區分的品種間，‘TT30’/‘TT33’、 ‘TCSG1’/
‘TCSG2’屬相同育種者的智慧財產權，於智慧財產權保護上，可視為同時保護同
一育種者的多個品種；‘TN16’與‘越光’為近似同源系，其所導入的 3 個基因中，
Ehd1 外顯子（Exon）上的 SNP 可以用來區分這兩個品種（資料未顯示），保護 不同育種者的智慧財產權與必要時之監控農產品產銷及品質等使用；此外，
‘TCSG2’高產且與‘TCSG1’同質性高，育成目的為取代‘TCSG1’成為新興推廣品 種，此政策方向將慢慢使我國‘TCSG1’的種植面積與產出大幅減少，故其雖無法 以現有套件區分，惟於監控農產品產銷部分將不會有太大的影響。
柯（2014）由篩選世界水稻品種建立可廣泛鑑別全球水稻品種的第二版水稻 品種鑑別系統，發現平均分散於 12 條染色體的分子標誌在 64 個臺灣品種間，有 18 組無法區別的品種，實際相符率大於期望相符率，顯示臺灣水稻品種可能因 次族群內親緣性等因素存在族群次結構，不利於以可廣泛鑑別全球水稻的品種鑑 別套件使用在鑑別臺灣水稻品種（柯，2014）。本研究目的之一為建立 SNP 品 種鑑別系統之篩選模式與優化的策略，雖研究結果可能因為親緣關係造成基因背 景相似度太高，使無法由建立的篩選模式找到能區分 3 組品種兩兩間的標誌，但 由標誌之 MAF 與 PIC 值，可推測本次建立的套件應具有符合期望的辨識率。
圖 2、Allele specific ( AS )系統增幅結果。以 3 支引子組成的 Allele specific ( AS ) 系統，側翼條帶約 700 bp，對偶基因專一條帶約介於 200-300 bp 之間。M 為 100-3000 bp 之 DNA ladder，由小至大分別為 100、200、300、400、500、600、
700、800、900、1000、2000、3000 bp；1 與 2 分別為 AS-primer 具有 SNP 基因 座之 A 對偶基因或 B 對偶基因的專一性，分別偵測 SNP 對偶基因 A 與 SNP 對 偶基因 B。(A)典型的增幅結果，具備側翼條帶與 SNP 專一性條帶，可藉由增幅 出基因座 A 之 SNP 專一性條帶，判定基因型讀值為 A；(B)側翼引子與對偶基因 專一性引子互相競爭的結果，有時對偶基因專一性引子黏合性較佳，可能造成側 翼條帶因增幅效率較差而看不到條帶，圖之基因型讀值為 A；(C)PCR 增幅結果，
雖側翼條帶與對偶基因專一條帶皆被增幅，但可藉由比較條帶強弱之差異，判讀 基因型讀值。圖之基因型讀值為 B；(D)PCR 無增幅產物；(E)條帶混雜且無目標 大小之條帶。
(A) (B) (C) (D) (E) M 1 2 M 1 2 1 2 M M 1 2 1 2 M
－500 bp
－500 bp
－500 bp
－500 bp
－500 bp
圖 3、兩兩品種間多型性量統計圖。(A) 以 41 個基因型分析結果不重覆的標誌
表 3、9 個候選 SNP 組合之兩兩品種間基因型差異數分佈。9 個候選 SNP 組合
表 4、水稻 SNP 品種鑑別套件之 SNP 資訊。SNP 分子標誌的遺傳圖譜位置資料來自於 MapDisto Genetics Software web site
( http://mapdisto.free.fr/cMconverter/ ) 上的 cM Converter；除了 PIC 值依本次研究結果計算，本表其餘資訊來自 Zhao 等學者(2011)文獻 提供之 44 K SNP 分子標誌分析 413 個水稻品種之結果，做為此 44K SNP 的基本資料。
SNP id Chr註 1 Pos註 2 cM註 3 Alleles註 4 Call rate Hetero註 5 MAFall註 6 MAFaus MAFind MAFtej MAFtrj PIC id1000955 1 p 1043946 7.28 G/A 0.985472 0 0.425061 0.25 0.344828 0.451613 0.135417 0.389838 dd1001675 1 q 42335049 177.18 G/A 0.997579 0 0.395631 0.140351 0.471264 0.368421 0.43299 0.483132 id2010412 2 q 24560641 98.66 G/A 0.992736 0 0.397561 0.267857 0.413793 0.4 0.257732 0.499792 id4005078 4 q 17434802 38.41 T/C 0.937046 0 0.302326 0.227273 0.47619 0.46875 0.092784 0.324865 id6003492 6 p 5181055 25.39 G/A 0.992736 0 0.480488 0.22807 0.383721 0.389474 0.257732 0.499792 id6005779 6 p 8979465 54.92 T/C 0.968523 0 0.3025 0.017857 0.345679 0.419355 0 0.149938 id7000308 7 p 1627513 7.56 G/A 0.970944 0 0.433915 0 0.116279 0.122222 0 0.369846 id8000978 8 p 3088782 26.1 C/A 0.992736 0 0.407317 0 0.310345 0.442105 0.103093 0.474802 id10000129 10 p 631626 1.83 A/G 0.96368 0 0.497487 0.446429 0.357143 0.244681 0.042553 0.424823 id10007137 10 q 22497992 83.57 A/C 0.995157 0 0.313869 0.089286 0.022989 0.5 0.453608 0.408163
註 1：Chr 為 SNP 位於第幾條染色體的位置，p 為短臂，q 為長臂。
註 2：Pos 為 SNP 在該染色體上的第幾個鹼基位置。
註 3：Alleles 為 SNP 的對偶基因型組合。
註 4：Hetero 為 SNP 基因座在 413 個水稻品種中異質結合的機率。
註 5：MAFall、MAFaus、MAFind、MAFtej 為 SNP 基因座於所有水稻品種（all）、早中稻（aus）、秈稻（ind）、溫帶稉稻（tej）之次要對偶基因頻度（MAF）值。
圖 4、水稻 SNP 品種鑑別套件於染色體位置示意圖。箭頭為 10 個 SNP 基因座之 位置，橘色箭頭為兩兩品種間僅 1 個標誌差異的「必選」標誌，若不考慮必選之 標誌，本次研究選到的 SNP 位置廣泛分佈於水稻的 12 條染色體。
表 5、AS 系統與 Tetra primer ARMS 系統之比較表。灰色為雙股 DNA，紅、藍、
桶、綠色箭號分別代表側翼引子（Flanking primer）與對偶基因專一性引子（Allele specific primer），星號代表 SNP 位置，其序列與 AS-primer A 相符，與 AS-primer B 不符。
Allele specific system (AS-system) Tetra primer ARMS system ( Reaction 1 )
( Reaction 2 )
( Reaction 1 )
3 primers / reaction 4 primers / reaction 1 genotype / reaction 2 genotype / reaction 設計成功率高
（130 個 SNP 位置可設計超過 90 組引子）
設計成功率低
（130 個 SNP 位置僅能設計 35 組引子）
PCR 適應性註1較高 PCR 適應性較低
註 1：PCR 適用之引子黏合溫度範圍越廣表示 PCR 適應性高；PCR 適用之引子黏 合溫度範圍越窄表示 PCR 適應性低。
基因型讀值：
HL21 TY4 TKG1 HL19 TYW2 TNG77 TK5 KH139
(A) G G G G G G G A
(B) G G G G G G G A
圖 5、比較側翼條帶大小差異對 AS 系統之影響。以 id6006625 SNP 基因座為例，
設計不同側翼大小之引子，偵測 HL21、TY4、TKG1、HL19、TYW2、TNG77、
TK5 和 KH139 等 8 個品種，每行分別偵測一個 SNP 基因型（A 或 G）；M 為 100-3,000 bp 之 DNA ladder。(A)側翼條帶大小為 286 bp，AS 條帶為 133 bp；(B)側翼條帶大 小 706 bp，AS 條帶大小 305 bp。
－500 bp
－500 bp
HL21 TY4 TKG1
HL19 TYW2
TNG77
TK5 KH139 M G A G A G A G A G A G A G A G A
(A)
(B)
HL21 TY4 TKG1 HL19 TYW2 TNG77 TK5 KH139 M
G A G A G A G A G
A G A G A G
A
圖 6、AS-primer 方向及序列造成之結果差異。以 8 個水稻品種（HL21、TY4、TKG1、
HL19、TYW2、TNG77、TK5 及 KH139)為例，M 為 100-3,000 bp 之 DNA ladder，
每個行偵測 1 個 SNP 基因型(A、T、C 或 G)。(A)二 SNP 對偶基因之 AS-primer 互
圖 7、AS-primer 之序列配對錯誤有無於梯溫 PCR 之差異比較。以 TT30 和 TT33 為例，M 為 100-3,000 bp 之 DNA ladder，每個行偵測 1 個 SNP 基因型。(A) AS-primer 序列與參考序列吻合時，通常增幅結果較不受溫度影響。(B) AS-primer 序列與參 考序列吻合，判讀基因型可能需由條帶強弱分辨，當黏合溫度太低時可能誤判其 基因型為異結合基因型。(C) AS-primer 3’端-3 位置具有 1 個錯誤配對鹼基，引子 黏合溫度較低，但黏合性差異較大，條帶皆為有/無之差異。
M 54°C 56°C 58°C 60°C
62°C M
TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33
M 54°C 56°C 58°C 60°C
62°C M
TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33
M 54°C 56°C 58°C 60°C
62°C M
TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33 TT30 TT33
Flanking
Allele specific (A) Allele specific (B)
Flanking Allele specific
Flanking Allele specific
(A)
(B)
(C)