SNP 探勘與分析

探勘 SNP 的方法主要有比對序列差異、利用 SNP 物性與化性上的差異加以 區分及以酶切方式辨識 SNP 三個大方向。

由比對序列差異探勘 SNP 是最多人使用的方法，序列的來源可能來自現有 資料庫或解序特定片段序列，除了模式植物阿拉伯芥（Schmid et al., 2003）外，

在大麥（Kota et al., 2001）、番茄（Labate and Baldo, 2005）等作物或是原核生 物如分支桿菌（mycobacterium）（Wang et al., 2010）等，都有成功探勘 SNP 例 子。隨著科學發展演進，以次世代定序於全基因體探勘 SNP，已從大豆（Lam et al., 2010）、小鼠（Frazer et al., 2007）、西瓜（Guo et al., 2013）等材料獲得數

以萬計的 SNP；值得一提的是，Baird 等學者建立限制酶位點標定 （Restriction-site Associated DNA, RAD）技術，以限制酶處理樣品並接上條碼序列（barcode）後，

再以次世代定序集中定序限制酶切位相鄰之序列，能同時完成多個樣品的高密度 SNP 探勘與基因型鑑別，改善全基因體定序過於廣泛導致得到過多累贅序列的 問題，並可於單次分析多個樣品（Baird et al., 2008）。

藉由偵測 SNP 造成 DNA 物性與化性不一致的表現探勘 SNP，如單股構型核 苷酸多態性（Single-strand Conformational Polymorphism(SSCP)-SNP）（Bertin et al., 2005）利用 SNP 造成單股 DNA 構型的差異探勘 SNP；溫度梯度膠體電泳

（Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE） （Rosenbaum and Riesner, 1987）、變性梯度膠體電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE） （Ge et al., 1999 ） 及 高 效 能 液 相 層 析 （ Denaturing High Performance Liquid

Chromatography, DHPLC）（Wolford et al., 2000）以溫度或化學藥劑使 DNA 變 性（denature）、復性（renature）後產生結構差異以探勘 SNP；Zn²⁺-cyclen-PAGE

（Kinoshita‐Kikuta et al., 2002）藉由 DNA 帶電荷差異影響電泳結果偵測 SNP；

高解析熔點法（High Resolution Melting, HRM）（Reed and Wittwer, 2004）則利用

SNP 造成雙股 DNA 變性溫度差異偵測 SNP。

以酶切探勘 SNP 也是常用的方法，利用限制酶辨識並裁切 SNP 差異序列組 合，如限制酶切片段長度多型性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）、酶切增幅片段多型性（Cleavage Amplified Polymorphic Sequence, CAPS）； 利用特異性核酸內切酶可辨識並水解單股 DNA 的特性，處理復性後產生的異源 雜合雙鏈（heteroduplex），偵測 SNP，如裂解酶切片段長度多型性（Cleavase Fragment Length Polymorphism, CFLP）（Lyamichev et al., 1993）、定向誘導基 因组局部突變（Targeting Induced Local Lesions in Genomes, TILLING）（McCallum et al., 2000）。

探勘 SNP 的系統同時也可做為 SNP 分析、檢測的工具，在已知 SNP 位置與 序列的前提下，除了前文提到的方法，也可藉由專一性引子、探針等策略檢測 SNP 基因型。在專一性引子的應用方面，Soleimani 等學者利用引子在 3’端較具 選擇性的特性，設計一組包含 SNP 側翼引子對（flanking primers）與 3’具 SNP 選擇性的對偶基因專一性引子（allele specific primer, AS-primer）組成之引子組 合，單次可增幅一個 SNP 基因型（Soleimani et al., 2003）。Latorra 等學者則以 甲基化修飾對偶基因專一性引子的構型，建立鎖核酸技術（Locked Nucleic Acid, LNA），優化對偶基因專一性 PCR（allele specific PCR, AS-PCR）之效果 （Latorra et al., 2003）；Ye 等學者於 SNP 的側翼序列設計成對的引子，並於 SNP 位置設

計在3’端具對偶基因專一性且兩個基因型互為方向相反的引子，共計 4 支引子，

進行 tetra primer ARMS PCR，可於 1 個 PCR 反應同時偵測 2 個 SNP 基因型（Ye et al., 2001）；Orum 等學者利用黏合性較 DNA-DNA 佳的肽核酸（Peptide nucleic

acid, PNA），與 DNA 序列互補為 PNA-NDA，阻礙 PCR 增幅，用以偵測 SNP（Orum et al., 1993）；Nikiferov 等學者將增幅目標位置之其中一引子磷酸化，於增幅後

高溫變性並以外切酶處理，保留磷酸化之單股，以標定不同顏色螢光的三磷酸雙 脫氧核苷酸（dideoxynucleotide triphosphates, ddNTP），延展（elongation）DNA 後，藉由比色法判讀 SNP 基因型（Genetic Bit Analysis, GBA）（Nikiforov et al.,

1994）；而 Ahmadian 等學者則是以焦磷酸測序（pyrosequencing）原理為基礎，

藉由偵測 DNA 延展時 dNTP 釋出磷酸根產生的能量激發光，成功判讀 SNP 基因 型（Ahmadian et al., 2000）。以探針偵測 SNP 的方法更多且廣泛地被應用，Huang 等學者以專一性探針上標定不同類型抗原，與外加抗體結合後，偵測剩餘抗體量 以判讀 SNP 基因型（Huang et al., 2002）；Nilsson 等學者以兩端分別為 SNP 基 因型專一性序列與其鄰近序列之倒置序列設計 Padlock 探針，於雜合至目標位置 時形成環狀構造，當 SNP 基因型與探針相符時，DNA 連接酶可使探針黏合成環 狀，並以滾環式複製（Rolling circle replication, RCR）增幅後判讀（Nilsson et al., 1997）；Ullman 等學者利用氧分子受到光能激發後，經由載體間電子傳遞機制，

建立 AlphaScreen 技術（Ullman et al., 1994），Beaudet 等學者分別在 SNP 專一 性引子或探針上標定電子傳遞載體，當成功增幅或雜合時，載體間距離足夠近，

將進行電子傳遞並釋放不同波長的光波，成功開發可使用 AlphaScreen 偵測 SNP 的 12 個專一性引子與 7 個探針（Beaudet et al., 2001）；以螢光探針偵測 SNP，

其好處是不需膠體電泳，可直接接收螢光強度進行結果判讀，也廣泛應用於科學 研究。螢光系統偵測 SNP 主要的方法有 TaqMan 系統與分子信標（Molecular beacon, MB），TaqMan 探針包含二個螢光標定，5’端為發光子（reporter），3’端 為消光子（quencher），探針與模板互補序列結合時，呈穩定狀態，當引子延伸 時因為 Taq DNA 聚合酶的外切功能（exonuclease）將與模版穩定結合的探針水 解，使得消光子脫離發光子而能接受外界能量激發螢光，藉由偵測螢光顏色，可 判讀目標序列的 SNP 基因型；MB 探針則是在游離狀態時呈穩定狀態，當與目 標序列結合時，激發螢光（Mhlanga and Malmberg, 2001）。

此外，近年來解序技術進步，隨著高通量資訊的產生與生物資訊學的發展，

有許多與農業相關物種的 SNP 晶片陸續且快速被開發，如水稻（Ebana et al., 2010;

Tung et al., 2010; Zhao et al., 2010; Yu et al., 2014）、玉米（Ganal et al., 2011）、

櫻桃（Peace et al., 2012）、番茄（Sim et al., 2012）、蘋果（Chagné et al., 2012）、

鮭魚（Salmo salar）（Dominik et al., 2010）、豬（Ramos et al., 2009）、鯰魚（Liu

et al., 2011）、茶（Fang et al., 2014）等，以此已知 SNP 序列之晶片分析未知樣

品的 SNP 基因型，可快速且大量的獲得 SNP 資訊，許多這些資訊被放於公開的 平台供學者們取用，使科學的研究更加快速有效率。