第二章 材料與方法
2.3 甘藷癒創組織之β-澱粉酶的分析
1 取 0.2~0.3g 甘藷癒傷組織，加入 20% (w/w)海砂、2% PVPP (w/w)
（Sigma，P6755）、80% (w/v)萃取緩衝液【0.05 M Tris-HCl (Merck，1.08382)，1mM EDTA , pH 8.0】 於冰浴下研磨均勻。
2. 放置室溫反應 1 小時，並每隔 15 分鐘震盪混合 1 次。
3. 使用 10000 ×g，4℃，離心 10 分鐘。
4. 取出上清液並定量其體積。
2.3.2 β-澱粉酶活性分析 2.3.2.1 試管分析
原理: β-澱粉酶在試管的活性分析是以專一性的商品化產品
(BETAMY method，Megazyme) 檢測，主要藉由β-澱粉酶會分解 p-nitrophenyl maltopentaoside 形成 p-nitrophenyl maltotrioside，接著α -Glucosidase 將其分解成產物 p-nitrophenol，在鹼性緩衝液下呈色，
測定其 400nm 的吸光値。
1. 取 10 μl 的酵素粗萃液利用緩衝液【0.1M Maleic acid、1mM EDTA、1mg/mL BSA (Sigma，A6793)與 0.02% sodium azide (Sigma，S2002), pH 6.2】以連續稀釋的方式稀釋 25 倍及 50 倍的酵 素液。
2. 將 50 μl Betamyl Substrate 溶液與稀釋的酵素液，各別放置 40℃預 先反應5 分鐘。
3. 吸取 50 μl 的酵素液，加入 50 μl Betamyl Substrate 溶液，40℃反應 10 分鐘後，馬上加入 750 μl Stopping 緩衝液【1% Tris, pH 8.5】並 用手搖晃均勻，以停止反應並呈色。
※註: 空白組取 50 μl 的酵素液，加入 750 μl Stopping 緩衝液後，
再加入50 μl Betamyl Substrate 溶液，依上述步驟進行分析。
4. 以分光光度計 (Beckman Coulter DU640) 測量 400 nm 吸光値，並 帶入以下公式計算:
Units/g = ΔA410 nm /反應時間 × 反應總體積/酵素反應量
× 1/
ε
mM × 樣品萃取體積/樣品克重 × 稀釋倍數 △A400 = Absorbance (sample) – Absorbance (blank)ε
mM p-nitrophenol in 1% Trizma base = 18.1 (at 400 nm)2.3.2.2 Native-PAGE 膠體電泳活性分析
原理: 利用 Native-PAGE 保留 β-澱粉酶在膠體中的活性，跑完電
泳後以可溶性的澱粉液當受質與膠片反應後加入碘液呈色，由於
β-澱粉酶將澱粉進行分解，造成膠片中β-澱粉酶的活性區會有負染的顏 色產生 (Wang et al.,1993)。
方法:
1. 準備鑄膠玻璃片擦拭乾淨，並選擇合適的間隔條（0.8 mm）
組裝完成後，先配製 resolving gel 的部分，將配方依序加入(表 2-1) 混合均勻，每片大約注入 3ml，再加入少量異丙醇（2-propanol）
使電泳膠面能成水平。
2. 待 resolving gel 凝結，將異丙醇吸出並進行 stacking gel 的配製 (表 2-1)，同樣注入玻璃片後，馬上插入齒槽等待膠片凝結。
3. 將電泳緩衝液【90 mM Tris、80 mM boric acid (Merck，1.00165) 與 5 mM EDTA】注入 tank 中，樣品各取 180 μg 的蛋白質量與 2 μl 的追蹤染料混合，並以商品化的 β-澱粉酶 (Sigma，A7005) 當 對照，於冷房中進行電泳分析 (120V，400mA)。當追蹤染料泳動 至底部，即可終止電泳。
4. 將膠片取出並做好記號後，放入澱粉液【1.2% soluble starch
(Sigma，S2630)，50 mM sodium acetate (Merck，1.06268), pH 5.9】
於37℃，反應 2 小時。
5. 反應完成後，將澱粉液倒出，並用超純水清洗膠片 2~3 次，加入 碘液【0.25 M potassium iodide (Merck，1.05043)，9 mM iodine (Serva，26700)】呈色。
2.3.3 西方墨點法
1. 取酵素萃取液先進行電泳分析 (120V，400 mA) 步驟同 2.3.2.2。
2. 剪裁適當大小的轉印膜，先以 100 %甲醇處理約 2~3 秒後，再用超 純水清洗。
3. 將跑好的膠片取出浸入轉印緩衝液中【25 mM Tris，192 mM glycine (Sigma，G8898), pH 8.3】平衡 30 分鐘。
4. 剪裁 4 片濾紙並用轉印緩衝液潤濕後，取其中兩片疊放(負極)，再
依序放入轉印膜、膠片及另外的兩片濾紙 (正極)，並且注意轉印 膜與膠片之間不可有氣泡存在。
5. 放置轉印器 (Tanon)進行轉印 1~1.5 小時 (100 V，400 mA) 取出轉 印膜，做好記號後以PBST緩衝液【含 0.3 M NaCl (Merck，
1.06404)、0.01M NaH2PO4 (J.T.Baker 3818-01) 與 0.05% (v/v) Tween 20 , pH 7.0】清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm (Major Science, MW-23)。
6. 加入 NET 液【0.25% (w/v) Gelatin、0.15 M NaCl、5 mM EDTA 與 50 mM Tris】中反應 1 小時。
※ 若時間不允許，此步驟可以 Netting 過夜處理。
7. 加入一抗 (以β-澱粉酶免疫兔子得到的血清，用 NET 稀釋 1000 倍) 室溫反應 1 小時。
8. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。
9. 加入二抗【Anti-Rabbit IgG (Vector，BA1000)，以 NET 稀釋 2000 倍】室溫反應 1 小時。
10. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。
11. 加入 Avidin-Biotin complex (Vector，AK-5000)，反應 30 分鐘。
※ A 液 (avidin)與 B 液 (biotinylated alkaline phosphatase) 利用 NET 稀釋 2000 倍，使用前需預先反應 30 分鐘。
12. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。
13. 加入呈色液【0.5g Nitro blue tetrazolium, NBT (Sigma，N6876) 溶 於10 ml 70% dimethylformamide (Sigma，D4551)，0.5g 5-Bromo-
4-chloro-3-indolyl phosphate, BCIP (Sigma，B0274) 溶於 10ml 100% dimethylformamide; 反應前取 66 μl NBT 溶液與 33 μl BCIP 溶液混合，於一小時內使用完畢】後開始呈色，反應直到有適量 的色帶出現後，水洗並晾乾。