研究動機與目的

雖然β-澱粉酶 (β-amylase，EC 3.2.1.2) 屬於一種外切苷酶

(exoglycosidase)的特性已為人熟知，然而至目前的研究而言，β-澱粉酶 的生理意義仍有多種解釋，例如當作儲藏性蛋白質 (Giese and

Heigaard，1984)，防衛性蛋白質 (Ohto et al., 1992; Takeda et al., 1995)，

以及逆境誘導蛋白質 (Datta et al., 1999，Todaka et al., 2000)等。過去將 甘藷癒創組織培養在高濃度 (8%) 蔗糖及黑暗條件下並未發現β-澱粉 酶明顯表現 (Wang et al., 1993); 綜合前人文獻得知，逆境誘導β-澱粉 酶活性必須配合光照 (Nakamura et al., 1991 ; Mita et al., 1995 ; Datta et al., 1999)。由於前人研究所使用的光源都是以全光為主，因此本論文 進一步利用 LED 提供不同的光質條件，探討不同光質對甘藷癒創組 織表現β-澱粉酶的影響。

此外，近幾年來發現，當植物細胞遭受逆境時，防禦性荷爾蒙、

NO 及 H₂O₂ 似乎是參與防禦機制調控的重要訊息傳遞媒介。因此本 論文亦同時透過不同試劑的處理，例如細胞壁受傷所釋放的寡醣類誘 導子– polygalacturonic acid、NADPH oxidase 的抑制劑– diphenylene iodonium、 NO donor– sodium nitroprusside、JA 及 SA 等，了解誘導 β-澱粉酶表現的訊息傳遞機制，進而推論β-澱粉酶在植物細胞的生理意 義。

第二章 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

甘藷癒創組織: 由台農 57 號甘藷的嫩葉所誘導，黑暗培養在含有 2 ppm NAA，0.2 ppm kinetin，3% sucrose，0.8% Agar (Merck，1.01614) 的 MS 培養基中，每隔一個月繼代培養 (Wang et al., 1993)。誘導β-澱粉酶 表現的培養基是 3 ppm kinetin，3% 或 8% sucrose，以藍光條件處理（光 照頻率60Hz，工作比 50%；光照週期 16 h / 8 h，光照強度 30 μmole m^-2s^-1。紅光及遠紅光光照強度分別為20 μmole m^-2s^-1與6 μmole m^-2s^-1， 黑暗處理作為對照組。

2.2 試劑處理:

[1] CH: Cycloheximide, 100 μM (Sigma，C7698)

[2] PGA: Polygalacturonic acid, 0.05% (w/v)(Sigma，P7276) 配置方法: 溶於10 mM NaOH 後，於4℃透析18小時。

[3] SNP: Sodium nitroprusside, 20 μM (Riedel-de Haën，31444) [4] JA: Jasmonic acid, 50 μM (Sigma，J2500)

[5] SA: Salicylic acid, 50 μM (Sigma，S7401)

[6] DPI: Diphenylene iodonium, 2 μM (Sigma，D2926)

配製方法: 溶於 DMSO (Dimethyl sulfoxide)，混合均勻。

[7] DCMU: 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea, 2 μM (Sigma，

D-2425)

配製方法: 溶於 DMSO，混合均勻。

[8] MV: Methyl viologen, 2 μM (Sigma，M-2254)

2.3 甘藷癒創組織之β-澱粉酶的分析 2.3.1 酵素液的萃取

1 取 0.2~0.3g 甘藷癒傷組織，加入 20% (w/w)海砂、2% PVPP (w/w)

（Sigma，P6755）、80% (w/v)萃取緩衝液【0.05 M Tris-HCl (Merck，1.08382)，1mM EDTA , pH 8.0】 於冰浴下研磨均勻。

2. 放置室溫反應 1 小時，並每隔 15 分鐘震盪混合 1 次。

3. 使用 10000 ×g，4℃，離心 10 分鐘。

4. 取出上清液並定量其體積。

2.3.2 β-澱粉酶活性分析 2.3.2.1 試管分析

原理: β-澱粉酶在試管的活性分析是以專一性的商品化產品

(BETAMY method，Megazyme) 檢測，主要藉由β-澱粉酶會分解 p-nitrophenyl maltopentaoside 形成 p-nitrophenyl maltotrioside，接著α -Glucosidase 將其分解成產物 p-nitrophenol，在鹼性緩衝液下呈色，

測定其 400nm 的吸光値。

1. 取 10 μl 的酵素粗萃液利用緩衝液【0.1M Maleic acid、1mM EDTA、1mg/mL BSA (Sigma，A6793)與 0.02% sodium azide (Sigma，S2002), pH 6.2】以連續稀釋的方式稀釋 25 倍及 50 倍的酵 素液。

2. 將 50 μl Betamyl Substrate 溶液與稀釋的酵素液，各別放置 40℃預 先反應5 分鐘。

3. 吸取 50 μl 的酵素液，加入 50 μl Betamyl Substrate 溶液，40℃反應 10 分鐘後，馬上加入 750 μl Stopping 緩衝液【1% Tris, pH 8.5】並 用手搖晃均勻，以停止反應並呈色。

※註: 空白組取 50 μl 的酵素液，加入 750 μl Stopping 緩衝液後，

再加入50 μl Betamyl Substrate 溶液，依上述步驟進行分析。

4. 以分光光度計 (Beckman Coulter DU640) 測量 400 nm 吸光値，並 帶入以下公式計算:

Units/g = ΔA410 nm /反應時間 × 反應總體積/酵素反應量

× 1/

ε

_mM × 樣品萃取體積/樣品克重 × 稀釋倍數 △A400 = Absorbance (sample) – Absorbance (blank)

ε

_mM p-nitrophenol in 1% Trizma base = 18.1 (at 400 nm)

2.3.2.2 Native-PAGE 膠體電泳活性分析

原理: 利用 Native-PAGE 保留 β-澱粉酶在膠體中的活性，跑完電

泳後以可溶性的澱粉液當受質與膠片反應後加入碘液呈色，由於

β-澱粉酶將澱粉進行分解，造成膠片中β-澱粉酶的活性區會有負染的顏 色產生 (Wang et al.,1993)。

方法:

1. 準備鑄膠玻璃片擦拭乾淨，並選擇合適的間隔條（0.8 mm）

組裝完成後，先配製 resolving gel 的部分，將配方依序加入(表 2-1) 混合均勻，每片大約注入 3ml，再加入少量異丙醇（2-propanol）

使電泳膠面能成水平。

2. 待 resolving gel 凝結，將異丙醇吸出並進行 stacking gel 的配製 (表 2-1)，同樣注入玻璃片後，馬上插入齒槽等待膠片凝結。

3. 將電泳緩衝液【90 mM Tris、80 mM boric acid (Merck，1.00165) 與 5 mM EDTA】注入 tank 中，樣品各取 180 μg 的蛋白質量與 2 μl 的追蹤染料混合，並以商品化的 β-澱粉酶 (Sigma，A7005) 當 對照，於冷房中進行電泳分析 (120V，400mA)。當追蹤染料泳動 至底部，即可終止電泳。

4. 將膠片取出並做好記號後，放入澱粉液【1.2% soluble starch

(Sigma，S2630)，50 mM sodium acetate (Merck，1.06268), pH 5.9】

於37℃，反應 2 小時。

5. 反應完成後，將澱粉液倒出，並用超純水清洗膠片 2~3 次，加入 碘液【0.25 M potassium iodide (Merck，1.05043)，9 mM iodine (Serva，26700)】呈色。

2.3.3 西方墨點法

1. 取酵素萃取液先進行電泳分析 (120V，400 mA) 步驟同 2.3.2.2。

2. 剪裁適當大小的轉印膜，先以 100 %甲醇處理約 2~3 秒後，再用超 純水清洗。

3. 將跑好的膠片取出浸入轉印緩衝液中【25 mM Tris，192 mM glycine (Sigma，G8898), pH 8.3】平衡 30 分鐘。

4. 剪裁 4 片濾紙並用轉印緩衝液潤濕後，取其中兩片疊放(負極)，再

依序放入轉印膜、膠片及另外的兩片濾紙 (正極)，並且注意轉印 膜與膠片之間不可有氣泡存在。

5. 放置轉印器 (Tanon)進行轉印 1~1.5 小時 (100 V，400 mA) 取出轉 印膜，做好記號後以PBST緩衝液【含 0.3 M NaCl (Merck，

1.06404)、0.01M NaH₂PO₄ (J.T.Baker 3818-01) 與 0.05% (v/v) Tween 20 , pH 7.0】清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm (Major Science, MW-23)。

6. 加入 NET 液【0.25% (w/v) Gelatin、0.15 M NaCl、5 mM EDTA 與 50 mM Tris】中反應 1 小時。

※ 若時間不允許，此步驟可以 Netting 過夜處理。

7. 加入一抗 (以β-澱粉酶免疫兔子得到的血清，用 NET 稀釋 1000 倍) 室溫反應 1 小時。

8. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。

9. 加入二抗【Anti-Rabbit IgG (Vector，BA1000)，以 NET 稀釋 2000 倍】室溫反應 1 小時。

10. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。

11. 加入 Avidin-Biotin complex (Vector，AK-5000)，反應 30 分鐘。

※ A 液 (avidin)與 B 液 (biotinylated alkaline phosphatase) 利用 NET 稀釋 2000 倍，使用前需預先反應 30 分鐘。

12. 以轉印緩衝液清洗三次，每次 10 分鐘，轉速約 65 rpm。

13. 加入呈色液【0.5g Nitro blue tetrazolium, NBT (Sigma，N6876) 溶 於10 ml 70% dimethylformamide (Sigma，D4551)，0.5g 5-Bromo-

4-chloro-3-indolyl phosphate, BCIP (Sigma，B0274) 溶於 10ml 100% dimethylformamide; 反應前取 66 μl NBT 溶液與 33 μl BCIP 溶液混合，於一小時內使用完畢】後開始呈色，反應直到有適量 的色帶出現後，水洗並晾乾。

2.4 甘藷癒創組織之 RT-PCR 分析 2.4.1 Total RNA 的萃取

原理: 利用 TRIzol^® 試劑抽取總量 RNA 後，加入 chloroform 分離 出水層與有機層，抽取位於水層的 RNA ，利用 isopropyl alcohol 使 RNA 沉澱，並利用 LiCl純化 RNA ，再以 ethanol 去除鹽離子，最 後將沉澱物進行烘乾並回溶，即得到總 RNA。

方法:

1. Diethylpyrocarbonate【DEPC (Sigma，D5758)】-free water 前處理:

以超純水加入 0.1% 的 DEPC 靜置 1 天。

2. 用具的準備:使用的研缽和夾子先以 180℃烘烤 3 小時，Tip、

microtubes 與 DEPC-free water 滅菌 3~6 小時。

3. 研缽先倒入液態氮預冷。

4. 取甘藷癒創組織 (重量不超過 0.1g) 加入液態氮研磨，並在研磨 過程中不斷倒入液態氮，直到研磨成細粉狀後，加入 1 ml的 TRIzol^® 試劑 (GIBCOBRL^®)，放置冰上。

5. 等到 TRIzol^® 試劑融化後，吸取至 microtubes，於 25℃反應 5 分鐘後，加入 0.2 ml Chloroform (Merck，1.02445)，用手劇烈搖

晃 15 秒，於 25℃反應 3 分鐘。

6. 以 10000 ×g，4℃，離心 25 分鐘。

7. 取 500 μl 的上清液，加入 500 μl Isopropyl alcohol (Merck，

1.09634)，用手稍微混合後，於 25℃反應 10 分鐘。

8. 以 10000 ×g，4℃，離心 10 分鐘。

9. 移掉上清液，加入 1 ml 的 75% Ethanol 用手搖晃清洗沉澱物 以去除鹽離子。

10. 以 6500 ×g，4℃，離心 5 分鐘。

11. 倒掉上清液，加入 0.3 ml LiCl (2M ; Sigma，L7026) 此步驟不要 混合。

12. 以 6500 ×g，4℃，離心 5 分鐘。

13. 移掉上清液，加入 1 ml 的 75% ethanol 用手搖晃清洗沉澱物。

14. 以 6500 ×g，4℃，離心 5 分鐘。

15. 將上清液移除乾淨，以 55℃烘乾，約 5~10 分鐘。

16. 用 100 μl 的 DEPC-free water 於 55℃回溶。

17. 取 6 μl 與 594 μl 的 DEPC-free water 混合，以分光光度計測量 260 nm 和 280 nm 的吸光値，並回推 RNA 的濃度:

※ 260 nm 吸光值是 1 時，RNA 濃度約等於 40 μg/ml RNA 濃度(μg/ml) = 260nm 吸光値× 40 × 稀釋倍數

18. 取 1 μg 的 RNA 以 DEPC-free water 定量至 10 μl 與 2 μl DNA ( 6 倍) loading dye (GeneMark) 混合，利用 1% Agarose gel (Seakem^® 50004) 與 TAE 緩衝液 (GeneMark) 進行電泳分析

(100V) 15 分鐘後，以 EtBr 染色 15 分鐘接著水洗 5 分鐘，

於 UV 光顯色，觀察 RNA 品質。

(照相系統: Computar, H620812 ;使用軟體及版本: EZ1D 1.2.3) 19. 分裝 RNA 並存放在-70℃冰箱保存。

2.4.2 反轉錄聚合連鎖反應 (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)

原理: 將甘藷癒創組織抽取的總 RNA 反轉錄為 cDNA 後，以 cDNA 為模板與β-澱粉酶專一性引子藉由 PCR 的技術，放大目標片 段。

2.4.2.1 First stand cDNA syntheis:

1. 甘藷之 β-amylase 與 actin 的 mRNA 序列由 NCBI (

National Center for Biotechnology Information

)資料庫搜尋後，利用 primer 3 程式設計，並經由生工公司合成。

Ipomoea batatas β-amylase primer

Forward primer: 5’tgtgaatgcggacaatgttt 3’

Reverse primer: 5’ tgttggcttcttcgaggact 3’ 產物: 785 bp Ipomoea batatas Actin primer

Forward primer:5’ actaccatgttccccggtat 3’

Reverse primer: 5’ tccacatctgttggagtgtg 3’ 產物: 163 bp 2. 每個樣品各取 1μg 的 RNA，加入 2 μl 的 Reverse primer，再以

DEPC-free water 將總體積補到 6 μl，混合均勻並 spin down。

3. 放至 70℃的熱水反應 5 分鐘，完成後馬上插入冰中，放置 5

分鐘。

4. 接著準備另一個 microtubes 依以下配方依序加入:

DEPC-free water 4.2 μl 5X buffer (Promega) 4.0 μl 10mM dNTP (Promega) 1.0 μl

MgCl₂ (Promega) 3.8 μl RTase (Promega) 1.0 μl

◎ 混合均勻後再加入

Primer/RNA 混合液 6.0 μl 總體積 20 μl

5. 進行反轉錄步驟，條件設定為:

25℃/5 分鐘→ 42℃/90 分鐘→70℃/15 分鐘→ 4℃∞

2.4.2.2 PCR amplify:

取 5 μl 的 100 bp DNA ladder (Basic Life) 加 1 μl 的 DNA loading dye (6 倍) 為分子量對照組，利用 1% Agarose gel 與 TAE 緩衝液 進行電泳分析 (100V) 約 30 分鐘，再以 EtBr 染色 15 分鐘，水 洗5 分鐘後，於 UV 光顯色。

2.5 抗氧化酵素活性分析

2.5.1 超氧歧化酶 Superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) 之萃取 與活性分析

原理:利用 β-mercaptoethanol 與 MnCl₂ 反應產生O₂^-，O₂^- 將 NADH 氧化成 NAD⁺，使 NADH 吸光值下降，SOD 可將 O₂^- 轉化成 H₂O₂，並抑制 NADH 被氧化成 NAD⁺ 而減緩340 nm 吸光值的下降 速率（Paoletti與Mocali，1990)。

方法:

1. 甘藷癒創組織 0.1~0.2g 以 50 mM 磷酸鉀緩衝液【potassium phosphate buffer (pH 7.4) 含 0.1mM EDTA】在冰上研磨萃取。

2. 使用 10000 ×g，4℃，離心 15 分鐘。

3. 取出上清液並定量其體積。

4. 278μl 反應液中含 50 mM 磷酸鉀緩衝液、0.4 μM NADH (Sigma，N8129)、4.7 mM EDTA 、2.3 mM MnCl₂ (Merck，

1.05927)、適量蛋白質粗抽液與 0.9 mM β-mercaptoethanol (Merck，8.05740) ;

※ 空白組以 25μl 緩衝液代替。

5. β-mercaptoethanol 加入後即開始反應，以 ELISA reader (BIO-TEK^®, POWER WAVE HT340) 每隔 1 分鐘測 340 nm吸 光值，至 20 分鐘。

6. 標準曲線:將 SOD (Sigma，S2515) 40 ng/μl 原液稀釋成 4 ng/

μl、2 ng/μl、1 ng/μl、0.5 ng/μl、0.25 ng/μl，並依上述步驟反 應。

7. 計算:

(1) 計算從第 8 分鐘到 20 分鐘每分鐘 340 nm 吸光值的變 化量。

(2) 計算抑制 NADH 吸光值下降百分比 (公式一)，並做 成抑制 NADH 吸光值百分比對 SOD (ng) 的標準曲線。

(3) 以準曲線計算出相對下降率 50%及樣品 SOD 的濃度 並計算樣品的 units (公式二)。

(4) 1 unit 定義為抑制 50% NADH 吸光值的 SOD (ng)。

抑制 NADH 吸光值下降百分比(%) = 樣品吸光值下降率/空白 組吸光值下降率 × 100%

(公式一) Units = 樣品 SOD 濃度/ 抑制下降百分比 50%的 SOD 濃度(ng)

(公式二)

2.5.2 Catalase (EC 1.11.1.6) 之萃取與活性分析酵素活性分析

原理: 利用 Catalase 反應後將 H₂O₂ 轉變成 H₂O，使 H₂O₂ 濃度減 少並測其吸光值 240 nm 下降速率 (Kato與Shimizu，1987)。

方法:

1. 取約 0.2 g 甘藷癒創組織，以 100 mM 磷酸鉀緩衝液 (pH 7.0) 含0.1 mM EDTA 在冰上研磨萃取。

2. 使用 10000 ×g，4℃，離心 20 分鐘。

3. 取出上清液並定量其體積。

4. 取 25 μl 酵素萃取液加入 1375 μl 50 mM 磷酸鉀緩衝液 (pH7.0)，最後加入 100 μl H2O₂ 【1M (Sigma，H1009)】，以 分光光度計測量 H₂O₂ 在240 nm 的下降速率。

5. 空白組以 100 mM 磷酸鉀緩衝液 (pH 7.0)代替。

6. 1unit活性定義為每分鐘 H₂O₂ 下降 1 μmol 的速率。

7. H₂O₂ 吸光係數ε為40 mM^-1 cm^-1。

2.5.3 過氧化酶 Peroxidase (EC 1.11.1.7) 之萃取與活性分析

原理: Peroxidase 會利用H₂O₂ 將 Guaiacol轉變成黃色

Tetraguaiacol，測定 Tetraguaiacol 於 470 nm 的生成速率

(Lin et al., 2002)。

方法:

1. 甘藷癒創組織 0.1~0.2g 以 50mM 磷酸鉀緩衝液【potassium phosphate buffer (pH 5.8)】在冰上研磨萃取。

2. 使用 10000 ×g，4℃，離心 20 分鐘。

3. 取出上清液並定量其體積。

4. 取 5 μl的酵素萃取液，加入 875 μl potassium phosphate buffer (pH 5.8)及 20 μl Guaiacol【21.6 mM (Sigma，G5502)】，最後加入 100 μl H2O₂ (39 mM，需新鮮配製)後，快速混合均勻，以分光 光度計讀取 470 nm 的吸光値，測量 Tetraguaiacol在 1 分鐘生 成的速率。

5. 空白組以 50 mM 磷酸鉀緩衝液 (pH5.8)代替。

6. 1unit 活性定義為每分鐘生成 1 μmol Tetraguaiacol 的速率。

7. 吸光係數ε為 26.6 mM^-1 cm^-1。

2.6 蛋白質定量

1. 使用 Bio-Rad Protein Assay，包括：

Protein Standard I.（500-0005）含 Bovine gamma globulin；

Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate（500-0006）。

2. 將 Bovine gamma globulin 標準品，配製成濃度線性範圍為 2.74 μg/μl 至 20.55 μg/μl。

3. 取待測物 200 μl 加入 50 μl protein dye，避光靜置反應 5 分鐘。

4. 於波長 595 nm 測定吸光值。

2.7 甘藷癒創組織之H

2

O

2

含量測定

原理: 利用過氧化氫會將反應液的亞鐵離子氧化成為三價鐵離子，三 價鐵離子再與二甲酚橙反應，使二甲酚橙的顏色由黃色轉變成為紫 紅色，測定560 nm的吸光値，即可得知H₂O₂的含量 (Jiang 等人，

1990)。

方法:

1. 研缽先以液態氮預冷，取甘藷癒創組織 (約 0.1~0.2g) 倒入液態 氮研磨均勻後，加入0.6 ml 的 50mM phosphate buffer 【含 10 mM

1. 研缽先以液態氮預冷，取甘藷癒創組織 (約 0.1~0.2g) 倒入液態 氮研磨均勻後，加入0.6 ml 的 50mM phosphate buffer 【含 10 mM

在文檔中 藍光及滲透逆境誘導甘藷癒創組織表現β-澱粉酶的機制探討 (頁 24-0)