生物分子表面修飾

由於整體研究架構是利用元件做為生物感測器，而感測的對象為檢體 中微量存在之特定蛋白質或抗體的濃度及含量。因此，針對生物分子的選 擇，我們將採用 NHS-Biotin 分子與 Streptavidin 蛋白質做結合，兩者間存 在著極強的親和力，且具有高度特異性。因此藉由此修飾系統，期望找出 清洗表面 10 分鐘，最後，把蓋玻片放入異丙醇(Isopropyl alcohol, IPA) 中，以超音波震盪機清洗 10 分鐘。利用三種不同有機溶劑清潔完後，

以去離子水將表面洗淨，並以氮氣槍將蓋玻片表面吹乾。

2. 於蓋玻片表面修飾 APTES

(1) 配置濃度為 2%的 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane)溶液，其分 散溶劑為乙醇，分子式為

H

NCH

CH

CH

Si(OC

H

)

。

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(4) 最後以氮氣槍將蓋玻片吹乾，接著放到 hotplate 上以 100℃烘烤 10 分鐘。加熱目的是為了使修飾於玻片表面上的 APTES 分子垂直立 於表面，這樣的構型將有利於之後與蛋白質的結合。蓋玻片上生物 分子修飾示意圖如圖 4-2。

圖 4-2 蓋玻片表面修飾 APTES 分子。

4.3.2 表面修飾 NHS-Biotin 分子

1. 修飾環境及載具

首先，如圖 4-3，在 PDMS 上以鑽孔器鑽出直徑為 6 mm 的孔洞，接 著再將表面已修飾 APTES 分子的蓋玻片黏附在 PDMS 孔洞的底部，

因此蓋玻片與 PDMS 兩者間即形成一個直徑為 6 mm，下方以蓋玻片 形成封閉凹槽環境。於此裝置中進行反應是為了固定生物分子於蓋玻 片上的修飾面積、另外，由於修飾液體的液面高度增加，因此也能增 加與反應物間的碰撞機會。

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圖 4-3 生物分子表面修飾之 PDMS 載具與蓋玻片示意圖。

2. 修飾 NHS-Biotin 分子

將 NHS-Biotin 粉末，分散於 Dimethyl sulfoxide (DMSO)和 1 倍 Phosphate buffered saline (PBS)溶劑中，配置成濃度為 1 mg/mL 的 NHS-Biotin 溶液。

(1) 於蓋玻片上修飾 APTES，步驟同 4.2 節。

(2) 接著，在 PDMS 和蓋玻片所形成的 well 中，加入 40 μL 的 NHS-Biotin 溶液，接著用 pippetting 的方式將液體混合均勻，以增加 Biotin 分子與 APTES 的碰撞機會並幫助兩者鍵結。靜置反應 overnight。最後蓋玻片上生物分子修飾如圖 4-4。

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圖 4-4 蓋玻片表面上有 APTES 和 NHS-Biotin 鍵結之示意圖。

4.3.3 表面修飾 Gold-labeled Streptavidin 蛋白

將鍵結 5 nm 金奈米粒子的 Streptavidin 蛋白質(濃度為 0.1 mg/mL、分 子量為 240 kDa)，以 1 倍 PBS 緩衝液進行 10 倍稀釋，濃度分別稀釋為 40 nM、4 nM、400 pM、40 pM、4 pM 五個濃度。

(1) 於蓋玻片上修飾 APTES，如 4.2 之步驟。

(2) 接著修飾 NHS-Biotin 分子，如 4.3 之步驟。

(3) 在 PDMS 和蓋玻片所形成的 well 中，為了把沒有與 APTES 鍵結 的 NHS-Biotin 去掉，減少非專一性鍵結對於實驗的干擾，我們以 PBS 溶液將試片清洗三次、每次三分鐘，最後再以去離子水清洗 一次。

(4) 接著在 PDMS 和蓋玻片所形成的 well 中，加入不同濃度的 Streptavidin 蛋白質，靜置反應 180 分鐘。分子修飾示意圖如圖 4-5。

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圖 4-5 蓋玻片表面有 Biotin 和帶有 5 奈米金粒子結合的 streptavidin 鍵結之示意 圖。

4.3.4 銀染(Silver enhancement)訊號放大技術

利用金奈米粒子的催化作用，銀染試劑中的銀離子可還原成金屬銀，

並沉積於金奈米粒子的表面上；藉由金屬銀包覆在金奈米粒子上，可將原 本微量、奈米尺度的生物免疫反應轉化成可判讀的訊號輸出。

(1) 於蓋玻片上修飾 APTES，步驟如 4.2。

(2) 接著修飾 NHS-Biotin 分子，步驟如 4.3。

(3) 將有修飾金奈米粒子的 streptavidin 蛋白與 NHS-Biotin 分子進行反 應，步驟如 4.4。

(4) 在 PDMS 和蓋玻片所形成的 well 中，為了把沒有與 NHS-Biotin 鍵結的 Gold-labeled Streptavidin 去掉，減少非專一性鍵結對於實 驗的干擾，我們以 PBS 溶液將試片清洗三次、每次三分鐘，最後

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再以去離子水清洗一次。

(5) 將溶液 A 和溶液 B，以等體積配製成銀染試劑，接著於每個 well 中加入 40 μL 的銀染試劑，反應 8 分鐘。

(6) 加入去離子水中止銀染反應，並以去離子水清洗試片。分子修飾 示意圖如圖 4-6。

圖 4-6 Streptavidin 蛋白上所鍵結金奈米粒子催化銀染反應發生之示意圖。

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