2. L. paracasei subsp. paracasei NTU 101 (NTU 101) 特性 含量少的乾燥狀態 (Vesterlund et al. 2012)。目前主流乾燥技術包含噴霧乾 燥 (spray drying)、冷凍乾燥 (freeze drying)、真空乾燥 (vacuum drying) 及 流動床乾燥 (fluidized bed drying)。表二概述上述乾燥技術的主要特點，其 中冷凍乾燥為目前最方便也最廣為使用的方法 (Broeckx et al. 2016)。
噴霧乾燥 a.
噴霧乾燥是一種快速且低成本的乾燥方法，可以生產出具有良好的 流動性、固定的水含量、均勻形狀及粒度分布的球形乾燥粉末顆粒 (dry spherical powder particles) (Sosnik & Seremeta 2015；Vandenheuvel et al.
2013)。乾燥過程包含了四個階段 (圖二)，首先將液體饋料霧化成噴霧
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表二、各種乾燥技術的主要特色概述
Overview of the main characteristics of different drying techniques Table 2.
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(Broeckx et al. 2016)
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圖二、噴霧乾燥過程 (A) 噴霧乾燥機示意圖 (B) 乾燥過程中的不同階段，包含 重要的加熱及脫水逆境。
The spray drying process. (A) A schematic overview of a spray dryer. (B) A Figure 2.
schematic overview of the different stages during the drying process with indication of the important heat and dehydration stresses. Black dots:
bacterial cells, w: water molecules.
(Broeckx et al. 2016)
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Julklang 2013；Peighambardoust et al. 2011)。
噴霧乾燥相較於其他乾燥技術為一種快速、連續且經濟的方法 (Peighambardoust et al. 2011；Sosnik & Seremeta 2015)，可在相對短的時 間內處理大量的培養液。其主要的優點是可以輕易地控制粉末的特性， 損傷 (Fowler & Toner 2006)。不僅冰晶的形成對益生菌有害，當水結晶 時剩餘未冷凍的部分同時濃縮剩餘溶液中的溶質，而導致化學及滲透損 傷。在初級乾燥步驟中透過真空昇華去除冰，而在次級乾燥步驟中藉由 去吸附作用 (desorption) 除去未冷凍水 (unfrozen water) (Maltesen &
van de Weert 2008)。由於水分在細胞完整性及穩定性中扮演重要的角色，
11 內常存在著交叉汙染的風險 (Barbaree & Sanchez 1982)，因此當冷凍乾 燥機交叉處理不同細菌菌種時要特別注意。 的喪失生存能力。前人使用原子力顯微鏡 (atomic force microscopy) 及 傅立葉轉換紅外線光譜 (fourier transform infrared spectroscopy) 分析真 空乾燥後的細胞，可以觀察到細胞壁及細胞膜為主要的受損細胞部位 (Santivarangkna et al. 2007)。因此保護細胞膜成為增強細胞存活力的主 要策略。然而關於使用此技術於乾燥、保存益生菌和脫水逆境方面的文
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圖三、冷凍乾燥 (A) 冷凍乾燥機示意圖 (B) 冷凍乾燥的步驟及最重要的逆境 因素簡述。
Freeze drying. (A) Schematic overview of a freeze dryer. (B) Simplified Figure 3.
overview of the process steps with indication of the most important stress factors.
(Broeckx et al. 2016)
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圖四、真空乾燥機示意圖。
Schematic overview of a vacuum dryer.
Figure 4.
(Broeckx et al. 2016)
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圖五、流動床乾燥機示意圖。
Schematic overview of a fluid bed dryer.
Figure 5.
(Broeckx et al. 2016)
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器中。流動床乾燥是一種重要的固定化技術，可以進一步減少益生菌製 品殘留的水分含量。
流動床乾燥所需時間比冷凍乾燥少，但較噴霧乾燥長。比起噴霧乾 燥，其在處理過程中使用較低溫度的乾燥空氣，使得熱失活損傷可以減 至最低 (Barbosa-Cánovas & Uliano 2004)。當使用流動床乾燥時，益生 菌必須與其他可以黏附的載體或基質粒子混合。最近的研究指出可使用 酪蛋白、麥芽糊精、纖維素、乳糖或 NaCl 顆粒作為合適的載體顆粒 (Bensch et al. 2014；Mille et al. 2004)。通常在流動床乾燥機中先加入載 體，然後使用噴嘴將細菌懸浮液霧化附著在載體上。或者也可以先藉由 種比例) (Tripathi & Giri 2014)。在冷凍乾燥及隨後儲存的過程中影響益生菌 存活率的因素包含內在因子、生長因子、亞致死處理、乾燥保護劑、儲存
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圖六、影響益生菌存活率的重要因素。
Important factors affecting viability of probiotics.
Figure 6.
(Tripathi & Giri 2014)
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後的乳酸菌在後續儲存期間也有類似的趨勢 (Carvalho et al. 2003)。
同一物種中不同的菌株在乾燥及乾燥後儲存的過程中也可能表現 出不同的特性。儘管這些菌株間的差異性較難以解釋，仍有些學者提出 一些假設 : (i) 由於基因組成 (genetic constitution) 上的差異可能使得 Lactococcus lactis 菌株間有不同的表現型 (O'Callaghan & Condon 2000) (ii) 不同細胞壁及膜的組成，其磷脂質的凝固點差異可能導致菌株間的 會使有毒的氧代謝物 (toxic oxygenic metabolites) 累積在細胞中，導致 細胞因氧化損傷而死亡。通常將此種氧氣致死的影響稱為氧氣毒性 (oxygen toxicity) (Talwalkar & Kailasapathy 2004)。氧是一種強力的氧化 劑，對於氧化還原電位 (oxidation reduction potential，ORP) 及乳酸菌 在生產培養及儲存過程中的存活率有顯著的影響 (Ebel et al. 2011)，為 了在製造過程中減低氧氣毒性，Ebel 等人 (2011) 在牛奶發酵中以通入 不同氣體 (air、N2 及 N2-H2) 的方式改變氧化還原電位。結果顯示通入 氮氣能提升 Bifidobacterium bifidum 的儲存存活率。氧化還原電位代表 一個環境系統中接受 (還原) 或提供 (氧化) 電子的能力。氧化還原為
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表三、生產乳酸菌所使用的不同培養方式及培養基組成
Different approaches of cell cultivation and media formulation for the Table 3.
production of LAB
(Coghetto et al. 2016)
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ClpS、ATPase family、CspA、NADH oxidase 及 NADH peroxidase (Desmond et al. 2004；Talwalkar & Kailasapathy 2003；Ventura et al. 2001)。
過去研究中提出 DnaK (Hsp70) 為一種有效重新折疊蛋白的細菌
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表四、過去研究中發酵條件對乳酸菌冷凍乾燥存活率的影響
Overview of studies on the influence of fermentation conditions on the freeze-drying survival of LAB Table 4.
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(Velly et al. 2014)
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chaperone 系統，該系統包含 DnaK、cochaperone (DnaJ) 及 nucleotide exchange factor (GrpE)。另一個重新折疊系統由 GroEL/GroES (Hsp60) chaperonin 所組成，包含 14-mer GroEL 蛋白及 heptameric cofactor GroES，在沒有 ATP 的情況下，GroEL/GroES 會形成大分子複合物 (將 兩個七聚環堆疊在一起)，可以透過疏水性作用與未折疊蛋白結合並重 新折疊 (Papadimitriou et al. 2016) (圖七)。
Prasad 等人 (2003) 的研究顯示藉由增量表現熱休克蛋白 (heat shock proteins，HSPs) 及合成糖解酵素 (glycolytic enzymes) 能改善細 胞在乾燥儲存期間的穩定性。大多數 cold shock proteins (CSPs) 家族的
Santivarangkna et al. 2008)。另一種機制是玻璃態過渡 (glass transition) : 凍乾保護劑會在乾燥過程中轉換成玻璃態 (非結晶)，成為一種具極高 黏度的固體 (黏度 ≥ 1012 Pa∙s)，而益生菌則被嵌入玻璃態的保護劑中並 且固定住 (Teng et al. 2017)。此外碳水化合物於乾燥過程形成玻璃態可 充當細菌的保護性介質，限制氧氣及水分交換 (Morgan et al. 2006)。
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圖七、乳酸菌修復受損大分子的主要機制示意圖。
Schematic representation of the main molecular mechanisms repairing Figure 7.
damaged macromolecules in LAB.
(Papadimitriou et al. 2016)
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目前常用的冷凍乾燥保護劑可歸類成醣類 (葡萄糖、蔗糖、乳糖、
海藻糖、果糖、麥芽糊精及菊糖）、糖醇 (木醣醇及山梨糖醇)、蛋白質
類化合物 (脫脂牛奶 (skim milk，SM) 、乳清蛋白及胎牛血清)、胺基 酸 (sodium glutamate) 以及抗氧化劑 (vitamin C 及 vitamin E) 等等不 同物質，用於改善微生物在冷凍乾燥和後續儲存過程中的存活率 (表 五)。
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表五、前人研究中所使用的冷凍乾燥保護劑
Overview of studies on the influence of lyoprotectant on the freeze-drying survival of micro-organisms Table 5.
Strain Parameters Lyoprotectant Storage condition Results Reference
L. paracasei subsp.
paracasei JCM 8130T
frozen : -20℃ for 16 h freeze-drying : 70 Pa at -35℃
for 21 h, secondary drying: 70 Pa at -35 to 5℃ for 8 h
disaccharides (sucrose and trehalose), polymers (maltodextrin; MD and bovine serum albumin;
BSA), and their mixtures
37℃ for 4 weeks after freeze-drying : all lyoprotectant had 95-100% survival rate
during storage : disaccharide-BSA had higher survival rates
10% (w/v) of glucose, fructose, lactose, trehalose and glycerol in deionized water, as well as whey
ND All lyoprotectants increased viabilities (trehalose : 66.2% the highest viability)
(Dimitrellou et al. 2016)
L. plantarum JH287 frozen : -70℃ for 24 h freeze-drying : <0.05 mbar at -45℃ for 72 h
10% glucose; 5, 10, and 20% sucrose; 10%
maltodextrin; 10% trehalose; 5, 10, and 20%
sorbitol; 10% lactose [w/v]) and 10% skim milk
4℃ and 30℃ for 2 months
All lyoprotectants increased viability except glucose
during storage : sorbitol and sucrose survival rates : 77.71, 59.37% (4℃); 1.20, 0.29%
(30℃)
(Lee et al. 2016)
Cryptococcus laurentii
frozen : -20℃ overnight freeze-drying : 5 Pa at -47℃ for 24 h
final conc. 10% (w/v) sugar (glucose, galactose, sucrose, trehalose) and 5% (w/v) skimmed milk
25℃ and 4℃ under dark condition for 90 days
after freeze-drying : sugars + SM significantly increased viability.
during storage : sugars + SM had more than 50% (25℃) and 70% (4℃) viability
(Li & Tian 2007)
Lac. lactis CRL 1584, L. lactis CRL 1827, Lac. garvieae CRL
frozen : -20℃ overnight freeze-drying : 110 millitorr at -50℃ for 48 h
10% (w/v) of lactose, sucrose, skim milk, whey protein and in the combination of each other (5%, respectively)
25℃ and 4℃ for 18 months
after freeze-drying : sugars + SM significantly increased viability except L.
plantarum CRL 1606 with whey protein
(Montel Mendoza et al.
2014)
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ND : not detected.
1828 and L.
plantarum CRL 1606
storage at 25℃ : milk + lactose had higher survival rates except for L. plantarum CRL 1606
L. reuteri CICC6226 frozen : -70℃ for 4 h
freeze-drying : 4 Pa at -50℃ for 48 h
15% (w/v) sucrose, 5%, 10% (w/v) trehalose, and 10% (w/v) reconstituted skimmed milk (RSM)
ND All lyoprotectants increased survival rate up to 60-90%, the higher were 10% RSM 95.98% ± 6.69% and 10% trehalose 93.20% ± 10.73%
(Li et al. 2011)
L. bulgaricus frozen : -40℃ for 12-24 h freeze-drying : 24 h
NaHCO3, MgSO4, sodium ascorbate and sodium glutamate
ND NaHCO3, MgSO4, sodium ascorbate, sodium glutamate conc. of 0.8%, 0.5%, 4.5%, 0.3% to survival rate 70.6%, 76.4%, 86.8% and 21.2%, respectively
(Chen et al.
2013)
L. bulgaricus frozen : -40℃ for 12-24 h freeze-drying : 6.93 Pa at -51℃
for 24 h
5%, 10%, 15%, 20%, 25% sucrose, lactose, skim milk, yeast and vitamin B2, respectively
ND sucrose, lactose, skim milk, yeast and vitamin B2 of 25%, 20%, 25%, 20% and 25% to survival rate 24.5%, 35.6%, 64.4%, 62.2%, and 16.3%, respectively
freeze-drying : 24 h
combination of skim milk (6% w/v) , trehalose (0, 4, 8% w/v) and sodium ascorbate (0, 2, 4%
w/v)
23℃ and 4℃ for 3 months
6% skim milk+8% trehalose+4% sodium ascorbate for freeze-drying, storage at 4℃
and 23℃ has 82%, 76%, 37% higher survival rate, respectively
(Jalali et al.
2012)
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儲存條件 a.
包裝材質的種類及儲存的環境 (儲存溫度、粉末的含水量、相對濕 度 、 氧 氣 含 量 及 接 觸 光 線 等 等 ) 對 菌 粉 的 存 活 率 有 顯 著 的 影 響 (Mattila-Sandholma et al. 2002)。菌粉在儲存期間的存活率是取決於其含 水量，而含水量在儲存期間又受相對濕度影響 (Poddar et al. 2014)。因 此益生菌菌粉應儲存在真空下、維持低水活性並以避光保存 (Carvalho et al. 2004)。
復水條件 b.
復水條件 (溫度、復水溶液的體積及復水時間)、復水溶液中物質 的物理特性以及復水溶液的滲透壓、pH 值及營養能量，皆能顯著地影 響益生菌恢復至 viable state 的速率 (Carvalho et al. 2004)，從而影響到 存活率。
復水溫度是影響冷凍乾燥及噴霧乾燥益生菌細胞恢復的關鍵因素。
對於嗜熱生物而言最適溫度介於 30-37℃ 之間，而嗜中溫菌則介於 22-30℃，但不管在任何情況下的復水溫度都不能超過 40℃ (Tripathi &
Giri 2014)。
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