真菌 NTOU4196 之乙酸乙酯層成分分離流程

取 NTOU4196 培養液 (30.0 升) 之乙酸乙酯層萃取物 28.1 克，使用 Diaion HP-20 膠體管柱 (2.8 cm i.d. x 25 cm) 進行梯度分離，流動相為 100% H2O 到 100% MeOH，每 10%為一個梯度，每個梯度使用 1 升的體積沖提，最終再以 2 升 的 80% Acetone 沖提，共收集 12 個分液分別為 Fr. 1-12。其中 Fr. 2 經由逆相高效 液相層析儀 (Reversed-phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)分 離純化得到化合物 1; Fr. 6 經 RP-HPLC 分離得到 7 個次分液 1–7，再以 RP-HPLC

取 Fr.6-6 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 35% MeCN，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 27.67 min，得到化合物 5 (13.64 mg)。

Chondroterpene F (6)

取 Fr.6-7 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 42.03 min，得到化合物 6 (4.63 mg)。

Chondroterpene G (7)

取 Fr.6-7 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。

取 Fr.6-2 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 42.33 min，得到化合物 13 (29.34 mg)。

Arthrosporone (14)

取 Fr.6-4 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。

取 Fr.6-1 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。

Fr.4 經過 silica gel 膠體管柱 (3.0 cm o.d. x 23 cm) 進行分離，流動相為 100% CH2Cl2 到 CH2Cl2-MeOH (5：1，v/v) 的梯度沖提，共收集 41 個 sub-fraction。

將 sub-fraction 38，40 及 41 以 RP-HPLC 分離純化得化合物 2-4 與 9-12。各化合物 之分離、純化之步驟分述如下。

Chondroterpene B (2)

取 Fr.4-38 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 15.57 min，得到化合物 2 (14.86 mg)。

Chondroterpene C (3)

取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 16.96 min，得到化合物 3 (2.38 mg)。

Chondroterpene D (4)

取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 25.31 min，得到化合物 4 (2.60 mg)。

(+)-Hirsutanol A (9)

取 Fr.4-40 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 15.76 min，得到化合物 9 (7.21 mg)。

Hirsutanol C (10)

取 Fr.4-40 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 18.03 min，得到化合物 10 (11.55 mg)。

Hirsutanol E (11)

取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 38.73 min，得到化合物 11 (5.92 mg)。

ent-Gloeosteretriol (12)

取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。

於滯留時間為 75.76 min，得到化合物 12 (3.72 mg)。

4.4 一氧化氮抑制試驗 (NO production inhibitory activity)

利用 Griess reagent assay 分析一氧化氮的濃度，來評估真菌中所生產的次級代 謝物是否對離體 RAW264.7 細胞與 BV-2 細胞產生的 NO 具有抑制作用。