NTOU4196 由國立臺灣海洋大學海洋生物研究所彭家禮教授實驗室所提 供，其從基隆八斗子之潮境公園內的細翼枝菜 (Pterocladiella capillacea) 中所單 離。此菌株藉由 ITS 分子鑑定，於 NCBI 的資料庫中比對與 Chondrostereum sp.
最為相近，但相似度僅 84%，未來有待進一步依外部型態進行鑑定確認。
4.3 真菌培養成分分離流程
4.3.4 真菌 NTOU4196 之乙酸乙酯層成分分離流程
取 NTOU4196 培養液 (30.0 升) 之乙酸乙酯層萃取物 28.1 克，使用 Diaion HP-20 膠體管柱 (2.8 cm i.d. x 25 cm) 進行梯度分離，流動相為 100% H2O 到 100% MeOH，每 10%為一個梯度，每個梯度使用 1 升的體積沖提，最終再以 2 升 的 80% Acetone 沖提，共收集 12 個分液分別為 Fr. 1-12。其中 Fr. 2 經由逆相高效 液相層析儀 (Reversed-phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)分 離純化得到化合物 1; Fr. 6 經 RP-HPLC 分離得到 7 個次分液 1–7，再以 RP-HPLC
取 Fr.6-6 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 35% MeCN，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 27.67 min，得到化合物 5 (13.64 mg)。
Chondroterpene F (6)
取 Fr.6-7 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 42.03 min，得到化合物 6 (4.63 mg)。
Chondroterpene G (7)
取 Fr.6-7 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。
取 Fr.6-2 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 42.33 min，得到化合物 13 (29.34 mg)。
Arthrosporone (14)
取 Fr.6-4 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製備 管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。
取 Fr.6-1 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 25% MeCN，流速為 2 mL/min。
Fr.4 經過 silica gel 膠體管柱 (3.0 cm o.d. x 23 cm) 進行分離，流動相為 100% CH2Cl2 到 CH2Cl2-MeOH (5：1，v/v) 的梯度沖提，共收集 41 個 sub-fraction。
將 sub-fraction 38，40 及 41 以 RP-HPLC 分離純化得化合物 2-4 與 9-12。各化合物 之分離、純化之步驟分述如下。
Chondroterpene B (2)
取 Fr.4-38 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 15.57 min，得到化合物 2 (14.86 mg)。
Chondroterpene C (3)
取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 16.96 min，得到化合物 3 (2.38 mg)。
Chondroterpene D (4)
取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 25.31 min，得到化合物 4 (2.60 mg)。
(+)-Hirsutanol A (9)
取 Fr.4-40 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 15.76 min，得到化合物 9 (7.21 mg)。
Hirsutanol C (10)
取 Fr.4-40 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 30% MeCN，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 18.03 min，得到化合物 10 (11.55 mg)。
Hirsutanol E (11)
取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 38.73 min，得到化合物 11 (5.92 mg)。
ent-Gloeosteretriol (12)
取 Fr.4-41 以 RP-HPLC 進行純化分離，使用 Thermo Hypersil-Keyston HS C18 半製 備管柱 (10 x 250 mm) 配合 RI 偵測器，流動相為 50% MeOH，流速為 2 mL/min。
於滯留時間為 75.76 min，得到化合物 12 (3.72 mg)。
4.4 一氧化氮抑制試驗 (NO production inhibitory activity)
利用 Griess reagent assay 分析一氧化氮的濃度，來評估真菌中所生產的次級代 謝物是否對離體 RAW264.7 細胞與 BV-2 細胞產生的 NO 具有抑制作用。
4.4.1 細胞培養
BV-2 細 胞 培 養 在 含 有 10% FBS (fetal bovine serum) 和 L-glutamine 、 penicillin、 streptomycin、HEPES 與 NaHCO3 的 DMEM (Dullbecco’s modified Eagle medium) 培養液中，培養條件維持在 37 °C 與 5% 二氧化碳/95% 空氣中[22]。
4.4.2 Griess reagent assay
將定量好的 BV-2 細胞 (5 x 105 cells/well) 分置於 24 wells 培養盤中，於恆 溫箱內培養 16 小時後，移除培養液後，加入不含酚紅的 DMEM 新培養液，並 加入溶於 DMSO 中的化合物包含： 空白對照組 (dimethyl sulfoxide； 0.1%) 、 compounds (1-17)，30 分鐘後給予 LPS 150 ng/ml ，反應 24 小時。取出細胞培養 液之上清 液，再 加入同 體積的 Griess reagent (1% sulfanilamide 接著 0.1%
naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride)，在室溫下反應 10 分鐘，利用 ELISA reader 於螢光波長 550 nm 下，測其吸光強度 (Optical density: O.D.)，並計算化 合物對於離體 BV-2 細胞產生一氧化氮之抑制強度[21]。
伍、討論 (Discussions)
本研究針對之醱酵液所含代謝產物進行一系列的分離、純化與結構解析，計 分離出 17 個化合物，其中 hirsutane-type 倍半萜類化合物 chondroterpene A-H (1-8) 及 (+)-hirsutanol A (9) 與 humulane-type 倍半萜類化合物 (+)-antrodol C (16) 為新化合物。其中的化合物 8、9、13、15 與 17 對經 LPS 刺激之 BV-2 細胞株 產生一氧化氮具有抑制效果，此結果可對應到其粗萃物所具有之一氧化氮產生的 抑制效果。
Chondroterpene A–H (1-8) 這一類的化合物，經資料庫搜尋其類似物，發現其 為 hirsutane-type 的骨架。Hirsutanols A-C 在 1998 年於分佈在印度洋及太平洋中 的蜂海綿 (Haliclona sp.) 分離出的未知真菌 (coll. no. 95-1005C) 分離得到[19]，其 後在源於肉質軟珊瑚 (Sarcophyton tortuosum) 的 Chondrostereum sp.也有分離到 hirsutanol A，對於大腸癌細胞 (SW620、 SW480 與 LoVo) 、肝癌細胞 (Hep3B、
圖 86、Cucumins A-G 之結構
圖 87、Hirsutenols A-C 之結構
類似骨架的化合物於瓜形大囊傘 (Macrocystidia cucumis) 中分離出 cucumins A-G (圖 86)，其中 cucumin A 具有抗菌活性與細胞毒性[23]。於毛韌革菌 (Stereum hirsutum) 中分離到 hirsutenol A-C (圖 87)，並具有抗細菌與抗真菌活性[24]。
藉由評估化合物一氧化氮抑制活性測試的強弱結果，可嘗試歸納其構效相關 性 (structure-activity relationship)，目前較有一氧化氮生成抑制活性為 8、9、13、
15 與 17，其中除 17 外皆為 hirsutane-type 的倍半萜，並且在 4 號碳上都接有共軛 羰基，除 13 外在 3 號碳上都接有末端雙鍵。
陸、各成分之物理數據 (Physical data)
Chondroterpene A (1) Colorless oil
[α] 27D + 44 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3389, 2943, 2864, 1688, 1657, 1455, 1369, 1309, 1146, 1064, 1006, 647 cm-1
1H-NMR 及13C-NMR 如表 7 與表 8
IR νmax：3740, 3421, 2961, 2931, 1692, 1635, 1459, 1387, 1266, 1056, 661 cm-1 UV (MeOH) λmax (log ε)：232 (4.12) nm
IR νmax：3373, 2958, 2929, 2871, 1681, 1627, 1455, 1386, 1043, 1006, 660 cm-1 UV (MeOH) λmax (log ε)：243 (3.90) nm
1H-NMR 及13C-NMR 如表 11 與表 12
IR νmax：3281, 2957, 2927, 2870, 1455, 1368, 1260, 1122, 1053, 676 cm-1 UV (MeOH) λmax (log ε)：246 (3.98) nm
IR νmax：3740, 3437, 2945, 2870, 1726, 1461, 1376, 1299, 1272, 1186, 1115, 1056, 1023, 948, 888, 667 cm-1
1H-NMR 及13C-NMR 如表 15 與表 16 HRESIMS: m/z 275.1608 [M + Na]+ calcd for C15H24O3Na, 275.1623
Chondroterpene F (6) White solid
[α] 27D + 76 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3619, 3300, 2944, 2867, 1693, 1463, 1052, 1043, 677, 660 cm-1
1H-NMR 及13C-NMR 如表 17 與表 18
IR νmax：3740, 3619, 2951, 2869, 1706, 1693, 1532, 1514, 1464, 1053, 677 cm-1
1H-NMR 及13C-NMR 如表 19 與表 20
IR νmax：3732, 2945, 2869, 2834, 1722, 1643, 1531, 1516, 1463, 1385, 1372, 1311, 1265, 1055, 1043, 677 cm-1
UV (MeOH) λmax (log ε)：235 (4.37) nm
1H-NMR 及13C-NMR 如表 21 與表 22
calcd for C18H23O2, 247.1695
IR νmax：3428, 3280, 2966, 1674, 1603, 1460, 1166, 1067, 1002, 885, 676, 621 cm-1 UV (MeOH) λmax (log ε)：283 (4.26) nm
HRESIMS: m/z 271.1303 [M + Na]+ calcd for C15H20O3Na, 271.1312
Hirsutanol E (11) White solid
[α] 27D + 122 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3373, 2944, 2867, 1645, 1455, 1387, 1310, 1056, 1005, 894, 661 cm-1 HRESIMS: m/z 275.1619 [M + Na]+
calcd for C15H24O3Na, 275.1625
ent-Gloeosteretriol (12) White solid
[α] 27D - 16 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3474, 3302, 2944, 2868, 1461, 1307, 1051, 989, 790, 662 cm-1 HRESIMS: m/z 277.1764 [M + Na]+
calcd for C15H26O3Na, 277.1782
Chondrosterin B (13) Yellowish oil
[α] 27D + 137 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3619, 2972, 2869, 1741, 1706, 1693, 1531, 1516, 1054, 677 cm-1 UV (MeOH) λmax (log ε)：302 (3.85) nm
HRESIMS: m/z 269.1138 [M + Na]+ calcd for C15H18O3Na, 269.1154
Arthrosporone (14) White solid
[α] 27D - 46 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3437, 2944, 2869, 1727, 1462, 1375, 1310, 1277, 1190, 1023, 675 cm-1 HRESIMS: m/z 275.1620 [M + Na]+
calcd for C15H24O3Na, 275.1625
Chondrosterin A (15) Yellowish oil
[α] 28D + 99 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 2947, 2869, 1693, 1624, 1532, 1516, 1464, 1394, 1315, 1259, 1054, 1024, 677 cm-1
IR νmax：3740, 3423, 2962, 2870, 1693, 1532, 1516, 1463, 1385, 1043, 1009, 907, 677 cm-1
UV (MeOH) λmax (log ε)：203 (3.60) nm
1H-NMR 及13C-NMR 如表 26 與表 27 HRESIMS: m/z 275.1615 [M + Na]+
calcd for C15H24O3Na, 275.1625
trans-2,3-Epoxydeca-4,6,8-triyn-1-ol (17) Yellow solid
[α] 28D - 33 (c 0.1, MeOH)
IR νmax：3740, 3619, 3302, 2960, 2922, 2866, 2223, 1706, 1693, 1532, 1516, 1464, 1368, 1056, 1024, 846, 746, 677 cm-1
UV (MeOH) λmax (log ε)：214 (4.75) nm
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