模擬試驗評估蘇力菌以色列 亞種對抗登革病媒蚊
模擬試驗結果 整理與分析
建立田野試驗方法
田野試驗評估蘇力菌以色 列亞種對抗登革病媒蚊
室內模擬試驗評估 殺滅效果與殘效性
田野試驗施以蘇力菌以 色列亞種對抗登革病媒
之成效評估
室外田野試驗評估 殺滅效果與殘效性
室內田野試驗評估 殺滅效果與殘效性 室外模擬試驗評估 殺滅效果與殘效性
第二節 材料與方法
(Valent BioSciences Corp, Illinois, USA)，VectoBac WG/WDG (Strain AM65-52)，
有效力價為3000國際標準毒物單位/公絲，Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 後多以Bti稱之。
(三)實驗劑量:劑量 8 公克/1000 公升，即以每 0.48 公克Bti/60 公升的水。劑量 4 公克 /1000 公升，則以 0.24 公克Bti/60 公升的水;實驗時投入容器中。
(四)實驗容器與實驗地點:PPE容器內裝60公升的自來水。在國立高雄大學，室外模擬試
組則於內側，皆未遮蓋，見附件四。
直接曝射處，陰暗且無任何日光燈照明，皆未遮蓋，見附件五。
(一)實驗期間: 埃及斑蚊幼蟲於 2008 年 6 月 12 日至 12 月 3 日進行測試；白線斑蚊幼 蟲於 2008 年 9 月 18 日至 2 月 5 日進行測試。
三、室外田野實驗
(一)供試藥劑:使用美國ValentBioSciences 所出品之蘇力菌水散劑型VectoBac
(Valent BioSciences Corp, Illinois, USA)，VectoBac WG/WDG (Strain AM65-52)，
有效力價為3000國際標準毒物單位/公絲，Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 後多以Bti稱之。
(二)實驗劑量:為對水域直接施藥劑量為 8g/1000L；對非水域施藥劑量為 500g/ha。
(三)實驗地點:針對於高雄市楠梓區五常里選以一人口稠密老舊公寓型住宅，興楠路 151
卵指數，為施藥期間之誘蚊產卵指數。而後不再施藥並繼續觀察其誘蚊產卵指數之病媒 蚊密度之一個月變化，6 月 16 日至 7 月 7 日，為施藥後測之誘蚊產卵指數。回收之誘蚊 產卵器中之產卵紙進行蚊蟲密度調查，算出試驗區域誘蚊產卵指數，以陽性率（%）表 示之，評估施用藥劑前、後誘蚊產卵指數是否降低(Gunasekaran et al., 2002)。
誘蚊產卵指數控制率＝ ( 1 - (施藥後(%) / 施藥前(%) ) ) × 100%
分。故實驗區塊共為 20 等分，若以最高水深 17 公分計算，每等分為 14.15 克。因建議 49.35 公尺。實驗涵蓋面積 125.85 公尺×49.35 公尺=6210.6975 平方公尺約 0.62 公頃。
為對非水域施藥劑量為 500g/ha。依該生物製劑的使用說明建議稀釋比例為 30-60L。故 每次施藥量為 0.62ha×500g/ha=310g。
因建議稀釋比例為 30-60L，將實驗區塊週圍以 25 公尺為一分作為 14 等分，長為
四、室內田野試驗:
(一)供試藥劑:使用美國ValentBioSciences 所出品之蘇力菌水散劑型VectoBac
(Valent BioSciences Corp, Illinois, USA)，VectoBac WG/WDG (Strain AM65-52)，
有效力價為3000國際標準毒物單位/公絲，Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 後多以Bti稱之。
Bora-Bora 品系 30 隻，約三齡末期至四齡初期幼蟲為供給實驗所用，每組三重複，觀察
(三)實驗藥品:1. 標準組：Bti (7992 ITU/mg) 2. VectoBac WG/WDG
(四)實驗藥劑配製:標準組與試驗組皆以去離子純水配製，4000 ug/l、2000 ug/l、1000 ug/l、500 ug/l、250 ug/l、125 ug/l、62.5 ug/l，包括七個測試濃度之Bti殺幼蟲劑 懸浮液，待加入去離子純水中，每個濃度各3重複。對照組，去離子純水不含任何藥劑。
(五)實驗步驟:於塑膠碗中盛 230mL 蒸餾水備用，以吸量管吸取 10mL 供試藥液加入已盛 裝 230mL 去離子純水之供試容器中。將內含約 20 隻供試埃及斑蚊幼蟲之 10mL 去離子純 水倒入已施加藥劑之供試容器中，處理後 24 小時觀察記錄試驗結果之各組死亡率。
(六)結果處理:
1.半數致死濃度(LC50)：以Polo Plus Version 1.0 LeOra Software 進行Probit Analysis.
分別求取標準劑及樣品之半數致死劑量LD50
(三)實驗藥品:1. 標準組：蘇力菌(7992 ITU/mg) 2. VectoBac WG/WDG
(四)實驗步驟:將去離子純水 9 公升 925 毫升(扣除 5 毫升內含 Bora-Bora 埃及斑蚊幼蟲 之去離子純水，每組三重覆共五組。)投入 0.08 公克之Bti 藥劑量，混和均勻。後取 95 毫升之含Bti 之水於塑膠杯中，置於 254nm 紫外燈下一個小時、三個小時、六個小時、
十二個小時及二十四小時，後投入 5 毫升內含 20 隻 Bora-Bora 埃及斑蚊幼蟲之去離子 純水，即為含有 8 公克/1000 公升Bti 藥劑之 100 毫升去離子純水，每組三重複，記數 其一個小時、二個小時、三個小時及二十四小時之死亡隻數，計算其死亡率。另有Bti 藥劑但完全不經紫外燈照射者為零個小時之對照組及不加入任何藥劑者之空白組，每組 三重複，同樣記數其一個小時、二個小時、三個小時及二十四小時之死亡隻數，並計算 其死亡率。
第三節 統計分析
一.%校正死亡率=（X-Y/X） × 100 (Abbott, 1987)，依公式計算。
X=% 控制組存活孑孓百分比；
Y=% 實驗組存活孑孓百分比。
二.半數致死時間（LT50），依機率分析Probit Analysis 計算以對數分析軟體進行LT50
三.卡方檢定（Chi-square test）
之 分析，以瞭解各族群對藥劑之感受性及不同劑量之差異性。
類別變項以卡方檢定，考驗各變項在實驗區與對照區個案的分佈情形是否有關聯。
四.Mann-Whitney 檢定
連續變項資料不符合常態分佈者以無母數檢定，比較實驗區與對照區與各變項間差異。
第肆章 研究結果
分)，4公克/1000公升組為20.77±1.4分、8公克/1000公升組為19.9±1.9分;於第1週的LT50 品系為 1167.0±556.6 分、4 公克/1000 公升組之感性品系為 1320.1±756.6 分;8 公克 /1000 公升組之野外品系為 2478.0±1937.7 分、8 公克/1000 公升組之感性品系為 1905.5
±2740.7 分，見表 8。
蚊幼蟲之 24 小時死亡率為 100%；第 0 週至第 13 週蘇力菌以色列亞種對埃及斑蚊幼蟲之 48 小時死亡率也有 100%。於第 21 週之 24 小時死亡率殺滅效果降至 50%上下，4 公克/1000 公升組之野外品系為 46.0±11.6%、4 公克/1000 公升組之感性品系為 45.2±14.9%、8 公 克/1000 公升組之野外品系為 62.8.4±6.6%、8 公克/1000 公升組之感性品系為 46.4±
19.7%。而第 23 週之 48 小時死亡率殺滅效果降至 50%以下，4 公克/1000 公升組之野外 品系為 37.2±29.3%、4 公克/1000 公升組之感性品系為 35.2±20.5%、8 公克/1000 公升 組之野外品系為 39.6±33.8%、8 公克/1000 公升組之感性品系為 48.8±26.0%，見表 9、
表 10。
室內白線斑蚊進行 20 週實驗，在第 0 週的LT50之平均值±標準差(單位:分)，4 公克 /1000 公升組為 22.7±2.3%、8 公克/1000 公升組為 23.1±2.6%;於第 17 週LT50之平均值±
標準差，4 公克/1000 公升組為 1732.4±209.4%、8 公克/1000 公升組為 1082.5±115.6%；
第 18 週由於寒流來襲，氣溫甚低，4 公克/1000 公升組水溫為 4.0±0.0℃、8 公克/1000
±218.6%、8 公克/1000 公升組為 481.3±16.6%，表 11。
斑蚊對於蘇力菌以色列亞種於室內投以藥劑之際在兩個小時內已全數死亡，半數致 死時間均少於半個小時。埃及斑蚊感性品系及野外品系於室內對蘇力菌藥劑半數致死時 間其殘效性於第 5、6、10、21 週呈現顯著增加，p<0.05，半數致死時間延長;白線斑蚊 於室內對蘇力菌藥劑其殘效性，半數致死時間在第 4、5、8、10、11 週呈現顯著增加，
p<0.05，半數致死時間延長。
其中進行交叉表卡方檢定(Crosstabulation:Chi-Square Tests)，就同一區塊，實 驗區前後誘蚊產卵指數之比較，在施藥前四日(5 月 5 日)的誘蚊產卵指數與之後觀測的
與 6 月 30 日，亦皆達顯著水準，p<0.05。
溝中，故其後並未再發現有埃及斑蚊孳生幼蟲情形。
原供試藥劑蘇力菌水散劑型VectoBac WG/WDG (Strain AM65-52)，有效力價為3000 國際標準毒物單位/公絲，經計算如下:
樣品活性＝（標準劑 LD50 /樣品劑 LD50
3439.355 IIU/mg＝（257.424 ITU/mg /598.174 ITU/mg
） x 標準劑國際單位
率為38.3±4.1%。累積六個小時照射者於投入埃及斑蚊幼蟲後之平均死亡率±標準差 (%)，1個小時之死亡率為0%；2個小時之死亡率為0%；3個小時之死亡率為0%，24小時之 死亡率為1.0±1.4%。而累積時數之12小時與24小時照射者對於埃及斑蚊幼蟲已完全沒有 殺滅能力，死亡率皆為零，與空白組無投入蘇力菌者沒有差異。
第伍章 討論
第一節 室外模擬試驗
過去有極多國外研究之文獻在對抗蚊種病媒控制，為生物製劑廣泛使用上可以略分 Bacillus thuringiensis (蘇力菌)及 Bacillus sphaericus (球狀桿菌)，在防治上也 可結合其他的防治方法，以綜合管理策略進行對於病媒幼蟲以生物防治方式而成蟲以化 學防治方式著手(Osborn et al, 2007)。Bti證明有效對抗許多蚊種，但施藥操作顯示 此微生物對斑蚊屬的防治上更為合適(Lee & Zairi, 2006)。
在實驗室模擬實驗結果當中，可以明顯看出於室內的實驗結果明顯較室外的實驗結 果效期為長，埃及斑蚊感性品系及野外品系於室外對蘇力菌以色列亞種藥劑半數致死時 間其殘效性在第 2、3 週呈現顯著增加，僅於第零週及第一週其 24 小時死亡率於 4 公克 /1000 公升組及 8 公克/1000 公升組之埃及斑蚊野外品系與埃及斑蚊感性品系為 100%，
而第二週其 24 小時死亡率於 4 公克/1000 公升組及 8 公克/1000 公升組之埃及斑蚊野外 品系與埃及斑蚊感性品系已下降為 30%以下，表 2 至表 4。
白線斑蚊於室外對蘇力菌以色列亞種藥劑其殘效性，半數致死時間在第 1 週呈現 顯著增加，其 24 小時死亡率 4 公克/1000 公升組於第 1 週就開始下降為 54.0±28.2%及 8 公克/1000 公升組為 91.6±18.8%，而 48 小時死亡率 4 公克/1000 公升於第 1 週開始下降 為 75.6±23.6%及 8 公克/1000 公升組為 98.0±4.5%;至第 2 週 4 公克/1000 公升組及 8 公 克/1000 公升組之 24 小時死亡率僅有 16.8±10.6%及 9.6±7.9%，而第 2 週 4 公克/1000 公升組及 8 公克/1000 公升組之 48 小時死亡率為 34.4±18.6%及 16.6±17.0%，均已低於 50%，見表 5 至表 7。
第二節 室內模擬試驗
上 甚低，在LT50明顯變短及死亡率增加，在Becker (1992)的實驗室中生物實驗結果顯示在 5℃的低溫下相較於 25℃之LC50及LC95 力菌降低了對於登革病媒的殺滅效果(Jones D.R.et al.,1991; Griego & Spence,
1978)。本實驗建議未來將蘇力菌使用在室內為佳，以延長蘇力菌之效期，故於後續相 型(Ansari, M. A., & Razdan, R. K., 1999; Dominic Amalraj, D. et al., 2000;
Gunasekaran et al., 2002; Seleena et al., 2001)。若使用粒劑或藥丸、藥片劑型
只能夠於開放且易於接近進入的水域，水散劑型可以以少量的水並使用手操作壓力噴霧 機來噴灑(Mulla et al., 1997)。由於戶外噴灑分為水域地區為屋前溝及屋後溝，和對 非水域區域包含堆積的垃圾、輪胎、屋頂排水溝、植披、葉梗、樹洞、落葉、地面的水 窪、帆布等；全數為難以深入的水域或是不易於以肉眼觀察的潛在性水域，故需以水散 劑型作為施藥材料極為合適。
在施藥當日為晴天無雨，而於施藥後於下次施藥期間卻不定期有豪大雨，亦或是成 日陰雨綿綿之情形，在文獻中都指出雨季或豪大雨都會造成藥劑成效之下降(Fillinger
& Lindsay, 2006; Mulla et al., 1997; Mulla et al., 1999)，驟雨可能沖走任何防 治藥劑形成浪費，因此於夏季雨量又大又急的情況下，Bti 藥劑雖能立即殺蟲，但應避 al., 2002; Mulla et al., 1997; Mulla et al., 1999)，就本實驗上尚有許多應改進 時宜，在實驗區旁為一大空地作停車場使用，而於停車場旁為一樹林，距實驗區塊約 50
表 23 過去蘇力菌相關文獻整理
VectoBac AS 1.2 l/ha2-8 天幼蟲密度下 降至 80%，VectoBac AS
VectoBac AS 1.2 l/ha2-8 天幼蟲密度下 降至 80%，VectoBac AS