研究動機

本研究的目的在於將海水中分離出具有纖維素分解能力的細菌，找出其最佳 的產酶培養條件，並且對於纖維素分解酶進行純化與特性分析，以期未來能應用在 產業上。

4 ELISA reader (ChroMate, Missouri, U.S.A)

SPECTRONIC 20D+ (Thermo, Wisconsin, U.S.A)

超微量全波長分光光譜儀 (Thermo Nanodrop 1000, Delaware U.S.A) 蛋白質液相層析系統 FPLC Ä KTA prime (GE , New Jersey U.S.A) 蛋白質電泳槽 (Bio East, Taipei, Taiwan)

電源供應器 (蛋白質電泳) (Major science, Taipei, Taiwan) 水浴槽 (Chin hsin, Taipei, Taiwan)

乾浴槽 (Genepure Technology, Taipei, Taiwan) 凍乾機 (Yu-Shing Biotech YFD100, Taipei, Taiwan)

2.2.2 實驗藥材

2.2.2.1 菌株培養

Peptone (BD, Maryland, U.S.A)

5

Yeast extract (BD, Maryland, U.S.A) Sodium Chloride (usb, Ohio, U.S.A)

Magnesium Chloride hexahydrate (Showa, Osaka, Japan) Agar (Amresco, Ohio, U.S.A)

Glucose (Acors, New Jersey, U.S.A) Tryptone (Sigma, Missouri, U.S.A)

Carboxymethyl cellulose sodium salt (Showa, Osaka, Japan)

2.2.2.2 酵素活性分析

Glucose (Acors, New Jersey, U.S.A)

3,5-dinitrosalicylic acid (Sigma, Missouri, U.S.A) Congo red (Sigma, Missouri, U.S.A)

2.2.2.3 蛋白質定量

BCA Protein Assay Reagent (Thermo, Illinois, U.S.A)

2.2.2.4 酵素純化

Ammonium sulfate (Showa, Osaka, Japan)

2.2.2.5 蛋白質電泳分析

Acrylamide-bis (Serva, Heidelberg, Germany) Ammonium persulfate (Serva, Heidelberg, Germany)

N, N, N', N'-Tetramethyl-ethylenediamine (Serva, Heidelberg, Germany) Coomassie Brilliant Blue R 250 (Serva, Heidelberg, Germany)

β-Mercaptoethanol (Serva, Heidelberg, Germany) Bromophenol blue (AppliChem, Darmstadt, Germany) Tris (Amresco, Ohio, U.S.A)

Sodium dodecyl sulfate (Sigma, Missouri, U.S.A)

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Glycerol (林純藥工業株式會社, Osaka, Japan)

2.2.3 培養基、液配製

LB agar：10 g tryptone, 5 yeast extract, 10 g NaCl, 15 g agar 加去離子水至 1000 mL，pH 調至 7。

LB broth: 10 g tryptone, 5 yeast extract, 10 g NaCl 加去離子水至 1000 mL，pH 調至 7。

2.2.4 蛋白質電泳藥品配製

Separating gel buffer （分離膠體）：18.2 g Tris 加去離子水至 100 mL， pH 8.8。

Stacking gel buffer （焦集膠體）：6.1 g tris 加去離子水至 100 mL， pH 6.8。

Sample buffer 5X （樣品緩衝液）：4 mL 1.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10 mL glycerol, 5 mL β-Mercaptoethanol, 2 g sodium dodecyl sulfate, 1 mL 1 % bromophenol blue。

Running buffer 10X （通用電泳緩衝液）：30 g tris, 144 g glycine, 加去離子水 係上較接近 (Pearson 2007)，為了進行這種相似度檢索 (similarity searching)，需先 取得菌株的基因序列，例如細菌的 16S ribosomal RNA 基因序列。

7 Biotechnology Information, NCBI) 的線上工具 Basic Local Alignment Search Tool ( BLAST ) (Altschul et al. 1990)與基因資料庫 GenBank (Benson 2013) 比對，可檢

8

或置放於 -20 °C 保存。

2.3.2 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)

聚合酶連鎖反應可以增幅出 DNA 特定區域片段，把抽取的 DNA 混合 DNA polymerase, oligonucleotide primers 及四種 deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs)，並使該混合液經過多個不同溫度的循環，一般進行 30 至 40 個 循環後，可使該特定片段增幅 2.5 億倍，使其容易偵測 (Munn 2011)。

本實驗中，16S rRNA 基因引子 (primer) 方面，利用廣效型引子 F8 ( 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ ) 及

R1492 ( 5’-CGGTTACCTTGTTAGGACTT-3’ ) 分別作為 forward 及 reverse primer (Fell et al. 2000)。調配反應液並置入 PCR 儀器中進行反應，溫度及時間依廠商

9 氨基酸序列等所謂操作分類單位 (operational taxonomic units, OTUs) 的演化關係，

通常以親緣關係樹的圖像表達不同 OTUs 的相關性，分子微生物學近年多應用 (internal node) 是該分支假設的共同祖先 (Page and Holmes 1998)。本節敍述親緣分 析的過程，最後建立出親緣樹，方法主要參考 Douady 與 Nesbo ( 2007) 所述。

親緣分析一般有四個步驟︰取得序列進行序列比對 (alignment)、選定一個適 當的序列替代模式 (substitution model)，以計算序列間的親緣距離、建立親緣關係 樹圖以及親緣樹的評估。本研究使用軟體 MEGA 6 (Tamura et al. 2011) 進行上述 操作，軟體操作的細節可參考 Hall (2013)。

10 (Jukes and Cantor 1969) ，該模式假設任一核苷酸轉變成自身外的核苷酸的機率相 等，於數學運算上較簡單。

2.3.5.3 建立親緣關係樹圖

本研究使用 neighbor-joining 方法 (Saitou and Nei 1987) 建立親緣樹圖，其是 一種群集演算法 (clustering algorithms)，該演算法的概念是將相似度高的觀測項目 進行分群歸類，相同群集中的事物有相同的特性。Neighbor-joining 方法利用統計 方式，把輸入的序列兩兩成對進行計算，並畫出總親緣距離最小的親緣樹樹形圖，

MEGA 6 亦內建有 maximum likelihood, maximum parsimony, minimum evolution 及 UPGMA 等方法。

11 NaOH 中，再稀釋至 250 mL，製備之二硝基水楊酸（Dinitrosalicylic acid，DNS）

試劑。 取 0.3ml、已知濃度為 0 mg/mL ~ 1 mg/mL 之葡萄糖溶液，加入 0.1 mL 之 二硝基水楊酸試劑中。 於 100℃ 之乾浴加熱 10 分鐘，靜置至室溫後，使用分光

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之相對穩定性 (%) (Balqis and Rosma 2011)。

2.16 抑制劑對酵素活性的影響

將純化後的酵素液和含有 5 mM 抑制劑 (β-ME、PMSF 和 EDTA) 的 50 mM 磷酸緩衝液混合，於室溫下靜置 30 分鐘，然後加入基質液並置於 37 °C 環境下 反應 1 小時。測試酵素活性，且以未添加抑制劑時的活性當作 100%，計算酵素在 添加不同抑制劑後的相對活性 (%) (Yan et al. 2009)。

2.17 界面活性劑對酵素活性的影響

將純化後的酵素液分別與 1.0 % (v/v) 之界面活性劑(SDS、Triton X-100 和 Tween 20) 混合於室溫下靜置 30 分鐘後，之後再與基質液於 37 °C 下反應一小時，

並測其纖維素分解酶之活性。以未加任何界面活性劑之酵素活性定為 100 %，依此 分析酵素在界面活性劑下之相對活性 (%) 。

2.18 纖維素分解酶之應用測試

將 100 ml 酵素液分別加入含有 0.1 g 的甘蔗渣、石蓴乾、影印紙以及微晶纖 維素之 50 mM 磷酸緩衝溶液 (pH 7) 中，置於 37˚C 中反應，並以加入 100 ml 之 去離子水作為對照組，每 12 小時測一次還原醣總量，測試酵素是否對於以上纖維 素來源具有水解之作用，以評估其未來在工業上之應用之潛力。

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第三章 結果

3.1 分離株的親緣關係鑑定

經定序後，分離株的 rRNA 長度為 1398 bp (附錄 4)，經過 BLAST ，顯示 95%

以上相似度的標準株共有五株，分別為 Vibrio fluvialis、Vibrio furnissii、Vibrio nereis、

Vibrio tubiashi 以及 Vibrio probioticus，其中以 Vibrio furnissii 和分離株的親緣關係 最為接近 (圖 1)。

19

20

21

22

3.7.3 蛋白抑制劑對酵素活性的影響

測 試 不 同 酵 素 抑 制 劑 對 分 離 株 所 產 纖 維 素 分 解 酶 的 影 響 ， 結 果 發 現 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA) 對此纖維素分解酶造成活性降低的影響最 大，其次是 phenylmethanesulfonylfluride (PMSF)，而 β-mecaptoenthol 對纖維素分 解酶的活性無顯著的影響 (圖 23) 。

3.7.5 界面活性劑對酵素活性的影響

在界面活性劑的影響方面，纖維素分解酶對 Triton X-100 的耐受性較高，仍具 有 75% 的活性，而纖維素分解酶在有 SDS 和 Tween 80 的環境下，活性降低到只 剩下約 25%。而 Tween 20 則使纖維素分解酶的活性約降低一半 (圖 24) 。

3.8 粗酵素液的實際應用測試

實測結果顯示，分離株所產之纖維素分解酶可分解甘蔗渣、石蓴、影印紙和微 晶纖維素，其中對微晶纖維素的分解能力最佳，其次是石蓴、影印紙，而對甘蔗渣 的水解能力最差 (圖 25)。

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4.5.3 酵素抑制劑對纖維素分解酶的影響

在酵素抑制劑方面，添加β-mercaptoenthol 對本纖維素分解酶幾乎沒有抑制作 用，推測酵素的蛋白結構中沒有雙硫鍵；而添加 EDTA 和 PMSF，則會使活性剩下 (Griffin, 1949)。本研究在進行 SDS-PAGE 活性染色時，即先將酵素與 SDS 作用，

完成泳動後，再以 Triton X-100 洗去 SDS ，最後再以清水洗去 Triton X-100，恢

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纖維結構屬於短鏈狀態，而且分佈很均勻，酵素的活性也和時間呈線性關係。

四種待測物當中，以甘蔗渣組別的酵素活性最不彰顯，甘蔗渣的纖維結構非常 堅實，在前處理時就感覺得到，不僅纖維很長，又不易剪斷，故纖維素分解酶要將 其分解亦困難許多。

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第五章 結論

一、分離株經鑑定後為弧菌屬(Vibrio)。

二、經硫酸銨沈澱及陰離子交換層析後，本酵素的純化倍率為 30.85，回收率為 0.08%。

三、經 SDS-PAGE 電泳後，本酵素包含三種纖維素分解酶，其分子量分別為 60 kDa、

36 kDa 及 20 kDa。

四、本酵素最適反應溫度為 50˚C，最適 pH 為 6。

五、本酵素在 4-40˚C 以及 pH4-9 相對有良好的穩定性。

六、本酵素會被 PMSF 及 EDTA 等蛋白抑制劑所抑制，可能為絲胺酸型或金屬型 蛋白質。

七、本酵素在 1% SDS 或 1% Tween 80 的作用下僅剩下約 25% 的活性，在 1%

Tween 20 的環境下會降低 55% 的活性，而在 1% Triton X-100 的作用下仍維持 75% 的活性。

八、本酵素對於微晶纖維素具有分解能力，故其中包含外切型纖維素分解酶；對 CMC 具有分解能力，故其中包含內切型纖維素分解酶。

九、本酵素對石蓴及紙張皆有分解能力，具有工業發展的潛力。

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參考文獻

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純化階段 体積 蛋白濃度(mg/ml) 總蛋白(mg) 活性(U/ml) 總活性(U) 比活性(U/mg) 蛋白純化比 總活性比 純化倍率 粗酵素液 250 8.86 2214.44 123.94 30985.00 13.99 100.00% 100.00% 1.00 硫酸銨沈澱 8 2.42 19.40 234.83 1878.67 96.86 0.88% 6.06% 6.92 管柱層析 4 0.45 1.81 195.69 782.78 431.68 0.08% 2.53% 30.85 表 1、纖維素分解酶的純化表。將粗酵素液經由硫酸銨沈澱後，再以陰離子管柱加以層析，每個階段測量其蛋白質濃度以及纖維酶活性，

製作成此純化表。比活性從 13.99 提高至 431.68，蛋白純化比為 0.8 %，而純化倍率為 30.85。

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圖 1、分離株 131 的 16S rRNA 親緣關係演化樹。

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圖 2、剛果紅染色法，中心為分離株 131 之菌落，經剛果紅染色，並以 1 M NaCl 脫色，其周圍顯示出透明帶，表示具有分解纖維素之能力。

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圖 3、分離株 131 與其他菌株的剛果紅染色比較圖。左上和左下為分離株 131 ， 可看出其整片培養基已呈現半透明狀，明顯比其他菌株更具有纖維素分解能力。

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圖 4、DNS 法的還原糖標準曲線。配置葡不同濃度的葡萄糖標準溶液後，以 DNS 法檢測之，並製作出標準曲線。待測樣品可利用此標準曲線回推出其所含的還原糖 濃度。

y = 0.4599x + 0.2036 R² = 0.993

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

OD 570

葡萄糖濃度(mg/ml)

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圖 5、蛋白質濃度標準曲線。利用牛乳清蛋白配置不同濃度的蛋白質，並利用 BCA 法製作蛋白質濃度標準曲線。待測樣品可利用同樣的方法測出對應的吸光值，並回 推出樣品內所含的蛋白質濃度。

y = 0.0009x + 0.357 R² = 0.9984

0 0.5 1 1.5 2 2.5

0 500 1000 1500 2000 2500

OD570

蛋白質濃度(ug/ml)

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圖 6、分離株在不同溫度 (^oC) 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在 25˚C、

30˚C 和 35˚C 的培養液中，每 24 小測其纖維酶活性。結果顯示，在 30˚C、培養 2 天的條件下，具有最佳活性。

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

0 1 2 3 4 5 6

U/ml

時間 (天) 25 30 35

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圖 7、分離株在不同 pH 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在不同 pH 的培 養液中，並每 24 小時測其纖維酶活性。結果顯示，在 pH 6、培養 2 天的條件下，

具有最佳活性。

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

0 1 2 3 4 5 6

U/ml

時間 (天)

pH6 pH7 pH8 pH9

40

圖 8、分離株在不同誘導物濃度 (CMC) 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在 含有 0 % 、0.5 %、1 % CMC 的培養液中，每 24 小時測其纖維酶活性。結果顯 示，在含有 1% CMC、培養 3 天的條件下，具有最佳活性。

圖 8、分離株在不同誘導物濃度 (CMC) 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在 含有 0 % 、0.5 %、1 % CMC 的培養液中，每 24 小時測其纖維酶活性。結果顯 示，在含有 1% CMC、培養 3 天的條件下，具有最佳活性。

在文檔中 弧菌屬分離株所產纖維素分解酶之純化與特性探討 (頁 13-0)