一、分離株經鑑定後為弧菌屬(Vibrio)。
二、經硫酸銨沈澱及陰離子交換層析後，本酵素的純化倍率為 30.85，回收率為 0.08%。
三、經 SDS-PAGE 電泳後，本酵素包含三種纖維素分解酶，其分子量分別為 60 kDa、
36 kDa 及 20 kDa。
四、本酵素最適反應溫度為 50˚C，最適 pH 為 6。
五、本酵素在 4-40˚C 以及 pH4-9 相對有良好的穩定性。
六、本酵素會被 PMSF 及 EDTA 等蛋白抑制劑所抑制，可能為絲胺酸型或金屬型 蛋白質。
七、本酵素在 1% SDS 或 1% Tween 80 的作用下僅剩下約 25% 的活性，在 1%
Tween 20 的環境下會降低 55% 的活性，而在 1% Triton X-100 的作用下仍維持 75% 的活性。
八、本酵素對於微晶纖維素具有分解能力，故其中包含外切型纖維素分解酶；對 CMC 具有分解能力，故其中包含內切型纖維素分解酶。
九、本酵素對石蓴及紙張皆有分解能力，具有工業發展的潛力。
29
參考文獻
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32
純化階段 体積 蛋白濃度(mg/ml) 總蛋白(mg) 活性(U/ml) 總活性(U) 比活性(U/mg) 蛋白純化比 總活性比 純化倍率 粗酵素液 250 8.86 2214.44 123.94 30985.00 13.99 100.00% 100.00% 1.00 硫酸銨沈澱 8 2.42 19.40 234.83 1878.67 96.86 0.88% 6.06% 6.92 管柱層析 4 0.45 1.81 195.69 782.78 431.68 0.08% 2.53% 30.85 表 1、纖維素分解酶的純化表。將粗酵素液經由硫酸銨沈澱後，再以陰離子管柱加以層析，每個階段測量其蛋白質濃度以及纖維酶活性，
製作成此純化表。比活性從 13.99 提高至 431.68，蛋白純化比為 0.8 %，而純化倍率為 30.85。
33
圖 1、分離株 131 的 16S rRNA 親緣關係演化樹。
34
圖 2、剛果紅染色法，中心為分離株 131 之菌落，經剛果紅染色，並以 1 M NaCl 脫色，其周圍顯示出透明帶，表示具有分解纖維素之能力。
35
圖 3、分離株 131 與其他菌株的剛果紅染色比較圖。左上和左下為分離株 131 ， 可看出其整片培養基已呈現半透明狀，明顯比其他菌株更具有纖維素分解能力。
36
圖 4、DNS 法的還原糖標準曲線。配置葡不同濃度的葡萄糖標準溶液後，以 DNS 法檢測之，並製作出標準曲線。待測樣品可利用此標準曲線回推出其所含的還原糖 濃度。
y = 0.4599x + 0.2036 R² = 0.993
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
OD 570
葡萄糖濃度(mg/ml)
37
圖 5、蛋白質濃度標準曲線。利用牛乳清蛋白配置不同濃度的蛋白質，並利用 BCA 法製作蛋白質濃度標準曲線。待測樣品可利用同樣的方法測出對應的吸光值，並回 推出樣品內所含的蛋白質濃度。
y = 0.0009x + 0.357 R² = 0.9984
0 0.5 1 1.5 2 2.5
0 500 1000 1500 2000 2500
OD570
蛋白質濃度(ug/ml)
38
圖 6、分離株在不同溫度 (oC) 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在 25˚C、
30˚C 和 35˚C 的培養液中，每 24 小測其纖維酶活性。結果顯示，在 30˚C、培養 2 天的條件下，具有最佳活性。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0 1 2 3 4 5 6
U/ml
時間 (天) 25 30 35
39
圖 7、分離株在不同 pH 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在不同 pH 的培 養液中，並每 24 小時測其纖維酶活性。結果顯示，在 pH 6、培養 2 天的條件下，
具有最佳活性。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0 1 2 3 4 5 6
U/ml
時間 (天)
pH6 pH7 pH8 pH9
40
圖 8、分離株在不同誘導物濃度 (CMC) 培養下的酵素活性。將分離株分別培養在 含有 0 % 、0.5 %、1 % CMC 的培養液中，每 24 小時測其纖維酶活性。結果顯 示，在含有 1% CMC、培養 3 天的條件下，具有最佳活性。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0 1 2 3 4 5 6
U/ml
時間 (天)
0% 0.50% 1%
41
圖 9、分離株在不同培養體積下的酵素活性。將分離株分別培養在 50 ml、75 ml、
100 ml 的培養液中搖瓶培養，每 24 小時測量其纖維酶活性。結果顯示，在 50 ml 培養 2 天的條件下，具有最大活性。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0 1 2 3 4 5 6
U/ml
時間(天)
50 ml 75 ml 100ml
42
圖 10、分離株在不同溫度 (oC) 下的生長情形。將分離株培養在不同的恆溫培養箱 中，每 24 小時測其菌濃度 (OD600) ，結果顯示，在 30˚C 的培養條件下，有最佳 的生長情形。
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 1 2 3 4 5 6
菌濃度(OD600)
時間(天) 25 30 35
43
圖 11、分離株在不同 pH 下的生長情形。將分離株分別培養在不同 pH 的培養液 中，每 24 小時測其菌濃度 (OD600)。結果顯示，在 pH 6 的條件下，有最好的生 長情形。
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 1 2 3 4 5 6
菌濃度(OD600)
時間(天)
pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
44
圖 12、分離株在不同溫度誘導物 (CMC) 濃度下的生長情形。將分離株分別培養 在含有不同 CMC 濃度的培養液中，每 24 小時紀錄其菌濃度。結果顯示，含 1
% CMC 的組別具有最佳的酵素活性 (濃度大於 1 % CMC 的培養液太過濃稠不易 進行實驗)。
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 1 2 3 4 5 6
菌濃度(OD600)
時間(天)
0.00% 0.50% 1%
45
圖 13、硫酸銨沈澱各分劃的纖維素分解酶總活性。利用硫酸銨沈澱法初步分離粗 酵素液中的蛋白質，以每 20 % 的飽和濃度作為一個分劃，共得到 5 個分劃，並 將各分劃經由沈澱、透析、冷凍乾燥、回溶等步驟得到蛋白質，並測其纖維酶活性。
結果顯示，大部分的纖維酶活性集中在 60-80 % 的分劃，故以此區間作為日後純 化纖維酶的目標區間。
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
0-20 20-40 40-60 60-80 80-100
活性(U)
硫酸銨濃度(%)
46
圖 14、硫酸銨沈澱各分劃的蛋白質濃度。利用 BCA 法測量各分劃的蛋白質濃度，
結果顯示在 60-80 % 的區間收集到濃度最高的蛋白質液。
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0-20 20-40 40-60 60-80 80-100
蛋白質濃度(mg/ml)
硫酸銨濃度(%)
47
圖 15、硫酸銨沈澱各分劃的總蛋白量。將各分劃所測得的蛋白質濃度乘以收集到 的體積，計算出其蛋白量。結果顯示，在 60-80 % 的區間收集到最多的蛋白質。
0 50 100 150 200 250 300 350
0-20 20-40 40-60 60-80 80-100
蛋白量(mg)
硫酸銨濃度(%)
48
圖 16、硫酸銨沈澱各分劃的纖維素分解酶比活性。比活性為單位質量的酵素活性，
結果顯示在 60-80 % 區間之纖維酶具有最高的比活性。
0 5 10 15 20 25
0-20 20-40 40-60 60-80 80-100
比活性(U/mg)
硫酸銨濃度(%)
49
圖 17、陰離子交換層析 (DEAE) 之管柱層析圖。0-70 分鐘使用 0% NaCl PBS buffer 將不吸附的蛋白沖提出來;70-200 分鐘將 NaCl 的濃度緩緩升高至 1% ， 過程中共出現 6 個 peak，將這些分離的蛋白質分別收集並經過濃縮離心管去鹽並 提高蛋白濃度後，測量其纖維酶活性及蛋白質濃度。
50
圖 18、SDS – PAGE 蛋白質電泳圖及活性染色。將同一批收集到的纖維酶同時進 行 SDS-PAGE 及活性染色，即可比較出具活性之蛋白所對應的分子量。左圖為利 用剛果紅染色法染出之纖維酶 (顏色較淡之 band)，右圖為進行 SDS-PAGE 後的 蛋白質分離情形，經比較後可提測本纖維酶具有三個活性分子，分子量分別為 60 kDa、36 kDa 及 20 kDa。
51
圖 19、纖維素分解酶在不同溫度 (oC) 之活性。將純化之纖維酶置於不同溫度中和 基質反應。結果顯示，在50 ̊C 時擁有最大的活性，其次為 40 ̊C，而在 4 ̊C 時活性 最低。
0 50 100 150 200 250 300 350
0 20 40 60 80 100
活性(U/ml)
溫度
52
圖 20、纖維素分解酶在不同溫度 (oC) 之熱穩定性。將纖維酶先置於各溫度下 30 分鐘，再與基質反應，測其活性。結果顯示，在 4 ̊C 有最佳的穩定性，而超過 50 ̊C 後，酵素活性驟減。
0 50 100 150 200 250
0 20 40 60 80 100
活性(U/ml)
溫度 (oC)
53
圖 21、纖維素分解酶在不同 pH 下之活性。在不同 pH 下測量纖維酶活性，結果 顯示，酵素在 pH 5-9 環境中皆有良好活性，而在 pH 6 的環境中，酵素具有最佳 活性 (圖中曲線分為三段是因為在三種不同緩衝液中測量的結果)。
0 50 100 150 200 250 300 350
3 4 5 6 7 8 9 10 11
活性(U/mg)
pH
54
圖 22、纖維素分解酶在不同 pH 下之穩定性。將纖維酶置於不同 pH 緩衝液中 30 分鐘，再與基質反應。結果顯示，酵素在 pH 6-8 有良好穩定性，且在 pH 6 具有 最佳活性。
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
3 4 5 6 7 8 9 10 11
活性(U/mg)
pH
55
圖 23、蛋白抑制劑對酵素的影響。將纖維酶加入 1 % 之不同的蛋白抑制劑，並測 其活性。結果顯示，βME 幾乎不造成影響，而 PMSF 使活性降低 35 %，EDTA 使 活性降低 45 %.。
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
Control β-mercaptoenthol EDTA PMSF
相對活性(%)
添加物
56
圖 24、界面活性劑對酵素的影響。將纖維酶加入 1% 不同的界面活性劑，並測量 其活性。結果顯示，tritonX-100 使活性降低 25 %，tween 20 使活性降低 55 %，
tween 80 使活性降低 75 %，而 SDS 則使活性降低 78 %。
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
Control SDS tween 20 tween 80 tritonX-100
相對活性(%)
添加物
57
圖 25、纖維素分解酶對甘蔗、微晶纖維素、石蓴和印影紙的分解能力。將四種基 質滅菌並烘乾後，各取 1 g 與纖維酶反應，每 24 小時紀錄一還原糖量。結果顯 示，酵素對微晶纖維素的分解能力最好，其次是石蓴及影印紙，對甘蔗渣的分解能 力最差。
0 500 1000 1500 2000 2500
0 12 24 36 48 60
還原糖產量(ug)
時間 (天)
甘蔗
微晶纖維素 石蓴
影印紙
58
附錄 1、纖維素的基本結構
59
附錄 2、纖維素的結晶型和非結晶型區域。
60
附錄 3、三種不同類型的纖維素分解酶作用方式。
61
62
最終硫酸銨百分飽和濃度 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 603 697 20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 469 557 硫 25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 436 522 酸 30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 402 488 銨 35 0 29 57 87 118 151 184 218 254 291 369 453 起 40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 335 418 使 45 0 29 59 90 123 156 190 226 302 383 百 50 0 30 60 92 125 159 194 268 348
分 55 0 30 61 93 127 161 235 313
飽 60 0 31 62 95 129 201 279
合 65 0 31 63 97 168 244
濃 70 0 32 65 134 209
度 75 0 32 101 174
80 0 34 139
90 0 70
100 0 附錄 5、硫酸銨百分飽和濃度表
63
附錄 6、最佳產酶培養條件的測試
25 30 35 6 7 8 9 0 0.5 1 50 75 100
1 * * * *
2 * * * *
3 * * * *
4 * * * *
5 * * * *
6 * * * *
7 * * * *
8 * * * *
9 * * * *
10 * * * *
11 * * * *
12 * * * *
temperature (
oC) pH CMC (%) volumn (ml)
64
附錄 7、培養基與培養液成分
Component PY agar PY broth LB broth
Peptone 3 g 3 g -
Trypton - - 10 g
Yeast extract 1 g 1 g 5 g
NaCl 25 g 25 g 10 g
MgCl2‧6H2O 2 g 2 g -
Agar 15 g - -
H2O 1000 mL 1000 mL 1000 mL
pH 7.8 7.8 7.8