氧氣

對細胞生長及染料還原脫色最重要之因素為氧氣(或溶氧)含量，主要因 為氧氣對微生物細胞之生理特性具有顯著之影響。當在染料還原時，若胞 外環境為好氧條件，氧氣所扮演之強電子接收者自然會抑制染料還原之進 行，這是由於細胞雖然氧化釋放出電子，但電子將優先釋放給氧氣作為電 子接受者，而非偶氮染料，並產生水為最終還原產物(Yoo et al., 2001)。因 此，溶氧之增加勢必不利於脫色之進行，然而氧氣所產生之抑制作用並非 不可逆之效應，若改通以不含氧氣之氮氣，則此種還原活性將再重新回復 到原厭氧狀態下相似之還原速率(Bragger et al., 1997)。氧氣對細菌偶氮還原 反應之抑制效應可歸納成對厭氧細菌之毒性作用，或是對偶氮還原酵素之 直接抑制，或是因氧氣較偶氮相關衍生物更易受還原所致(Semde et al., 1998)。而在厭氧條件下，原則上偶氮鍵受還原後，無法再進一步繼續被分 解，若更改為好氧條件，則反應性偶氮染料分子將會被完全礦化，這是因 為偶氮染料受還原後所產生之芳香族胺化合物可在有氧條件下，進行羥化 及開環作用所致(如圖 2.3) (Meyer., 1981)。因此，多數染料廢水會採用先厭 氧還原偶氮鍵後，再利用好氧分解芳香胺化合物之兩階段處理程序。但兩 階段式處理程序需注意控制其間之平衡，當對已還原之染料溶液再度曝氣 則可能會導致溶液之色度產生加深之作用(或稱為回色作用)，這是因為於厭 氧條件下受還原芳香胺成芳香胺中間物，此類中間物在氧氣存在之條件下

產生自發性不穩定之情況，這將導致氫氧根及胺根氧化形成醌(quinones)及 醌亞胺(quinone imine)，此類化合物可再次雙聚合(dimerization)或聚合化 (polymerization)而形成新的深色發色團(如圖 2.5)，但若以適當控制下之厭氧 /好氧操作，則會產生良好之處理效果(Bromley et al., 2000)。

O 而造成脫色活性將下降(Chang et al., 2001b)，但在某些全菌體細胞條件下，

由於細胞內調控，偶氮還原酵素具有相當熱穩定性且可在60 ℃下仍可於短 時間內維持微生物活性。而以固定化條件培養細胞，載體提供微環境 (microenvironment)來保護菌體，則可使最佳脫色容忍溫度再予以提高。

2.2.7 pH 值

一般利於脫色之 pH 值通常是在中性或微鹼性條件下，且在較強之酸/

鹼值下其脫色速率會明顯受到抑制。因此染整廢水通常需先加以進行緩衝 作用，來提高生物脫色之效果，而且由於偶氮鍵受生物還原時所產生之芳 香胺代謝物會導致pH 值上升(Willmott. 1997) (以本研究所使用之指標性染 料Reactive Red 141 以 A. hydrophila NIU01 脫色為例，含 300 mg L^-1 RR141 之LB 培養基下，脫色前 pH 值約為 6.92，脫色後(染料濃度低於 10 mg L^-1) pH 值約為8.73，由於苯胺(脫色所造成之中間物)之鹼度並不高，因此 pH 值之 改變可能是因中間物受分解而產生其他胺類或由微生物攝取酵母萃取物後 所產生之代謝物所導致)，在 pH 值 7.5- 9.0 間對偶氮還原之影響不大。Chang et al. (2001b)更發現由弱酸調至中性(pH 5.0-7.0)時，染料還原速率增加約 2.5 倍，而在中性至弱鹼性(pH 7.0-9.5)時，脫色速率對 pH 值並不敏感。

2.2.8 染料濃度

染料濃度對脫色效率具直接之影響性，因高濃度染料或其他共同存在於 廢水之污染物具有毒性所導致。一般而言可以酵素催化程序之 Michaelis- Menten (M-M)動力學來描述其行為：

[ ] ^S [ ] ^S

V

m

+

= Κ

ν

其中ν表在給定基質濃度[S]下之反應速率，而 V_max為在飽和濃度下之最大 速率，而K_m表 Michaelis 常數。M-M 動力學之應用可預測包含生物質量負 荷或維持特定脫色速率之操作溫度。關於脫色動力學而言，Wuhrmann et al.

(1980)發現脫色形成之代謝物對菌體產生毒性，導致起始脫色後脫色速率將 比模式預測之一級反應更為減少，而在高濃度染料下脫色所需時間則更加 延長。過去研究亦針對P. luteola 及 Aeromonas hydrophila 產生生長刺激或 抑制性作探討，發現抑制毒性與化學結構之差異可能有所關聯(Chen, 2006;

Chen et al., 2009b)。Sani et al. (1999)發現於 1-10μM 之染料(如：Crystal violet, malachite green, pararosaniline, ethyl violet, brilliant green 及 magenta)濃度較 易被脫除，但當染料濃度高於30μM 時脫色率將下降。但 Dubin 及 Wright 亦曾提及染料濃度對脫色速率無任何影響之結果，此種結果與非酵素性還 原機制相符，此種機制之調控機制與染料濃度無關 (Dubin et al., 1975)。

2.2.9 染料結構

某些偶氮染料結構對細菌細胞具阻抑效果(Bras et al., 2001)，簡單結構 及低分子量之染料通常具較高之脫色速率，而脫色難度將隨加入染料之分 子量增加 (Sani et al., 1999)。於最終非酵素還原機制，還原速率受偶氮染基 周圍之電子密度影響極大，當苯環上之拉電子基(如-SO₃H, -SO₂NH₂)與偶氮 鍵呈對位時，會使還原速率增加(Walker et al., 1971)。Nigam et al.(1996)指 出具有羥基(hydroxyl groups)或胺基(amino groups)之偶氮化合物較含有甲基 (methyl groups)、甲氧基(methoxy groups)、磺基(sulpho groups)、硝基(nitro groups)之偶氮化合物更易被分解，而脫色亦與染料分子上之偶氮鍵數目有

關，單偶氮較雙偶氮易脫色，Hu (2001) 更指出單偶氮染料濃度增加時，其 脫色速率亦隨之增加，但在雙偶氮及三偶氮染料條件下，雖然染料濃度增 加，但脫色速率仍維持不變。部分研究(Greaves et al., 1999)歸納出染料種類 與脫色程度之相關聯性。Hitz et al. (1978)歸納出數個論點：(a)酸性染料由 於含有磺酸基而影響脫色效率，當磺酸基數目增加會降低脫色效率，(b)直 接性染料具良好脫色效率，其磺酸基數目與脫色效率無關，(c)反應性染料 之脫色效率較低。磺酸基之脫色效率與脫色反應機制有關，若脫色發生於 胞內，則磺酸基之存在會產生質傳阻抑，造成染料分子無法穿透細胞膜，

因此隨磺酸基數目增加則脫色速率下降。但是當脫色發生於胞外，則磺酸 基之存在對脫色速率影響較小。Kulla (1981)發現能以培養條件馴養調控產 生對特別染料結構具高專一性之偶氮還原酵素，其中 Orange I 偶氮還原酵 素可還原Orange I 之偶氮鍵及其對位羥基之衍生物，另一種 Orange II 偶氮 還原酵素則對Orange II 之偶氮鍵及其鄰位羥基之化合物更具專一性。由於 磺酸基為良好拉電子基，致使偶氮基團之電子雲密度降低，讓偶氮基更具 親電子性，更利於還原脫色之進行，因此磺酸化染料(拉電子基)較羧化染料 (推電子基)更易還原。Zimmerman et al. (1982)更歸納出對細菌能還原 Orange II 之結構通則：(a)萘環鄰位必須有羥基，(b)於偶氮鍵之鄰近帶電荷基團會 阻礙反應，(c)染料之次級極性取代基會降低酵素親和力並抑制反應，(d)苯 環上具拉電子基團會增加反應速率。

2.2.10 電子提供者

有機電子提供者或氫之氧化結合脫色程序，Bras et al. (2001)證明添加葡 萄糖或乙酸根離子之類之電子供應者會明顯刺激偶氮鍵之還原斷裂。而不 同電子供應之半反應熱力學亦不相同；所以，反應速率受電子供應者的種 類影響甚鉅。因此對不同生物脫色系統其生理之電子供應者相當重要，因 為此步驟不僅增加染料還原速率，亦為還原反應之酵素路徑指標，例如：

對染料分子而言，蟻酸鹽(formate)為厭氧還原電子傳遞途徑最有效之電子供 應者，這顯示代謝途徑中蟻酸脫氫酵素必定參與其中，此輔助基質(原有電 子供應者)之濃度更決定還原物質(中間電子供應者)之生成速率。經由有機 基質氧化正常電子傳遞之共酵素(coenzyme)還原物質亦可扮演偶氮染料還 原之電子供應者(Plumb et al., 2001)。某些化學物，如硫柳汞(thiomersal)及 對氯汞基苯甲酸鹽(p-chloromercuribenzoate)可抑制 NADH 產生系統乙醇脫 氫酵素活性，而NADH 為染料還原必須產生之還原物質，因此 NADH 之產 生速率為導致偶氮染料還原抑制之速率決定步驟。

2.2.11 還原電位

脫色過程取決於電子供應者及接受者之還原電位，因此其速率決定步驟 涉及染料及胞外還原介質之氧化還原平衡。還原電位乃是一分子是否會接 受電子(即受還原)之難易度指標，因此染料脫色速率越高其還原電位越趨負

(Bromley et al., 2000)， Bragger 等人指出偶氮染料降解速率增加其半波還原 電位(half-wave potential)亦會增加(越正值)，而偶氮結構之半波電位與其脫 色速率之對數值具一線性之關係(Bragger et al., 1997)。此種還原速率與染料 結構之電化學性質間之關聯性，並不涉及胞膜滲透及酵素結合等結構相關 之現象。於厭氧條件下，系統欲達到高脫色效率，需具備低氧化還原電位 (<-400 mv)之環境。因此當系統之還原電位於最負值時其去色速率最大，但 當還原電位上升則脫色速率產生下降 (Bromley et al., 2000)。

2.2.12 氧化還原介質

由於具高電荷磺酸基偶氮染料無法穿透細胞膜，因此染料還原反應必須 伴隨額外細胞還原活性，此活性可藉由氧化還原介質之存在來達到，如黃 素(flavins)於細胞中穿梭還原物質以促進胞外偶氮染料之非酵素性還原作 用，極少量氧化還原介質就足以啟動此種電子傳遞。而此類介質之氧化還 原電位約在-200 至-350 mv，且添加合成之電子攜帶者(electron carriers)可加 速細菌細胞之染料還原速率。quinone- hydroquinone 氧化還原對可扮演此類 介質之作用，quinone 經由一電子還原成 hydroquinone 自由基，或由兩個電 子還原成hydroquinones(如圖 2.6)，對偶氮染料還原而言，經由一個電子快 速轉移還原成陰離子自由基，而後經第二個較慢的電子轉移形成穩定之二 階陰離子(dianion)，然後 hydroquinone 與染料直接化學反應而受氧化。運用

天然且生物可分解之 quinone(如：指甲花醌(lawsone))具有可脫色之處理潛 力，因此在無添加任何具環境危害疑慮之物質下可提高環原速率。Lourenco et al. (2000)發現於高溫殺菌過程細胞發生某些脫色現象，這說明於不存在 微生物活性之情況下仍有可脫色之還原因子之客觀因素存在。因此可知，

染料還原反應之速率決定因子涉及氧化還原介質、介質與染料之電位關係 及相對於介質之還原酵素專一性等。

O O

2e

OH

OH H⁺

2

quinone hydroquinone 圖2.6 醌(quinine)之還原途徑

2.3 固定化生物反應器

固定化技術應用於工業早已行之有年，舉凡食品、醫藥、廢水處理等工 業皆早已廣泛應用由來已久，由於製程成本及經濟效益之考量，遲至 1990 年初期才有被應用於廢水處理之實廠應用案例。固定化技術最早始於 1970

固定化技術應用於工業早已行之有年，舉凡食品、醫藥、廢水處理等工 業皆早已廣泛應用由來已久，由於製程成本及經濟效益之考量，遲至 1990 年初期才有被應用於廢水處理之實廠應用案例。固定化技術最早始於 1970