本實驗收集的病人是年齡大於 7 歲仍有夜尿的台灣兒童和正常的對照組。本
實驗是經由中國醫藥大學附設醫院人體試驗委員會通過，所有參加本實驗的兒童 均大於7 歲，並且在參與實驗前均填寫基因試驗同意書。所有的病人在參與本實 驗前簽署同意書。於數次門診安排中完成臨床分析及原發性夜間遺尿評估表登 錄。
所有原發性夜間遺尿病童的性別喚醒分數，有無合併白天症狀，（如頻尿、
尿急等），便秘均加以登錄，其中尿床病童如果不是原發性夜間遺尿，神經性膀
胱或已知泌尿道結構異常者，泌尿道感染或腎功能異常者，則排出本實驗，所有 的病童均接受相關的理學檢查和神經學檢查，並且他們的尿比重應大於1.015。
受試者納入及排除條件
納入條件
1. 七歲以上的孩童在沒有神經學或尿路系統異常的前提下，在夜晚睡眠時一週
有一次以上不自主的排尿現象
2. 區分有無白天頻尿或尿急等多症狀夜間遺尿或單一症狀夜間遺尿
(polysymptomatic or monosymptomatic NE).
排除條件
1. 次發性夜間遺尿- 曾經有半年沒有夜間遺尿
2. 神經性排尿功能異常
3. 尿路系統異常
4. 目前正有泌尿道感染
5. 尿比重低於 1.015
6. 腎功能異常
頻尿的定義
不到兩小時就要去解尿一次或一天至少小便八次以上
便秘的定義
一週解便的次數不到三次並持續三週以上 由睡眠中清醒的困難度評分31
當有人在房內輕聲交談或開燈能甦醒( 1 分) 當有人叫你名字能甦醒( 2 分)
當有人大聲叫你名字或聽到鬧鐘聲響能甦醒( 3 分) 當有人在耳邊大聲叫你名字或搖你能甦醒( 4 分) 當房屋內有巨大聲響或振動能甦醒( 5 分)
當身體站立起來能甦醒( 6 分)
當身體站立起來並且被人攙扶行走能甦醒( 7 分) 當身體被人帶離開床都不能甦醒( 8 分)
第二節 、實驗步驟
DNA抽取與純化
1. 先將 elution buffer 加熱至 70℃備用
2. 在 1.5ml 的離心管中加入 500μl 的 extraction buffer，後加入 100μl 的全血並
混和均勻。
3. 靜置於室溫中 5min。
4. 將 GFX 管柱放置於 2ml 的收集管中備用。
5. 將所有的萃取物加入 GFX 管柱；高速離心（8000rpm）1min
6. 丟棄離心至收集管中的液體後將 GFX 管柱放回原來的 2ml 的收集管 7. 加入 500μl 的 extraction buffer 到 GFX 管柱中；高速離心（8000rpm）1min
8. 丟棄離心至收集管中的液體後將 GFX 管柱放回原來的 2ml 的收集管 9. 加入 500μl 的 wash buffer 到 GFX 管柱中；高速離心（8000rpm）1min
10. 丟棄離心至收集管中的液體後將 GFX 管柱放回原來的 2ml 的收集管 11. 高速離心（12000rpm）3min 以使管柱乾燥
12. 丟棄收集管；並將 GFX 管柱放置入新的 1.5ml 的離心管中
13. 加入 50μl 預先加熱（70℃）的 elution buffer 於管柱中的玻璃纖維盤中。
14. 靜置於室溫中 1min
15. 高速離心（12000rpm）1min 以收集純化的 DNA
基因分析 PCR-RFLP
一、 試劑：
甲、2X O’in 1 DNA polymerase (YT006-100)
乙、BspeI 限制酶 丙、3% agarose gel 丁、EtBr
戊、PCR 引子 P1: 5- CAGCCACCACAGTTCAGTTC-3’; P2: 5’- CGGCTGTCAGTAAAGCAGAC-3’
二、所需之儀器：PCR machine，DNA 電泳槽，瓊脂膠片照相系統 三、實驗步驟：
A. PCR
1. 在 0.2ml PCR 管子依下表加入試劑和 Genomic DNA DNA
Ingredients Volume (μl) 2X O’in 1 DNA polymerase 10
Primer P1 (20μM) 1 Primer P1 (20μM) 1 Genomic DNA (50ng) X
H2O Y
Total volume 20
2. 混和均勻並離心使試劑集中於管子底層。
3. 依照下表設定 PCR machine
Steps/cycles 95℃ 50℃ 72℃
Step1/1 cycle 5 min
Step2/3 cycles 1 min 1 min 1 min Step3/1 cycle 7 min
4. 將準備好的反應管放入機器中進行 PCR 反應。
B. 3% 瓊脂膠片的製備
(1) 準備電泳膠膜盤，並將樣本孔梳插上，放置於平穩桌面或無塵操作 台上備用。
(2) 以微量分析天平分別秤取 3g 的 agarose 粉末。
(3) 依次倒入三角錐形瓶內，加入 100ml 0.5 X TBE Buffer。
(4) 混合均勻之。
(5) 以保鮮膜將錐形瓶口封住，並於瓶口上以 tip 鑿些孔洞，以便錐形 瓶內外透氣之用。
以微波爐加熱溶解
(6) 將溶解好的膠體溶液放置於桌面或抽氣櫃中，去除保鮮膜,待冷卻
至70℃左右。
(7) 小心將膠體溶液倒入電泳膠膜盤中，大盤約 25 ml、小盤約 15 ml
左右，厚度約4 mm，注意膠片不可以有氣泡凝固於膠片中央。
(8) 關掉抽氣開關。
(9) 置於室溫，等膠體冷卻之後，小心拔開樣本孔梳。
(10) 將瓊脂膠片放入電泳槽中使用或於夾鏈塑膠袋中保存待用。
C. 瓊脂膠片電泳分析：
(1) 取一片瓊脂膠片放置迷你電泳槽內。
(2) 將迷你電泳槽內倒入適量之 0.5 X TBE buffer
(3) 取一小片 parafilm 在上面先點上追蹤染劑 (loading dye) 約 1 μl 左 右。
(4) 取 3 μl 檢體與追蹤染劑混合均勻。
(5) 以 Pipetman 吸取全部混合液加入瓊脂膠片的 well 內。
(6) 以 Pipetman 吸取 3 μl 標準核酸 (ladder marker) 加入瓊脂膠片適當
的well 內。
(7) 將電泳槽電源打開，選擇 100 V，通電約 25-30 分鐘。
(8) 將電泳槽電源關閉。
(9) 完成待測。
D. BspeI 切割 DNA 片段
1. 在 0.2ml PCR 管子依下表加入試劑。
Ingredients Volume (μl) PCR mixture 8.5
BspeI buffer 1
BspeI 0.5 Total volume 10
2. 混和均勻並離心使試劑集中於管子底層。
3. 將反應置於 37℃作用 2 小時後進行 3%瓊脂膠片電泳分析。
候選基因選取(candidate gene search) (表一)
在本實驗開始之初，我們體篩選出數個基因位點位於第 8、12、13、22 對染
色體上，同時調控畫夜生理節奏、膀胱容量、排尿反射、中樞神經系統、睡眠或 甦醒相關的神經傳導物質(圖一)，總共有 32 個基因位點分別位在四個不同的分
子，包括 AVP、5HTR2A、CYR61、DRD5 等，但是我們在這 32 個位點中，只 發現我們的病人在5HTR2A 上有基因的多型性（表二）。
第三節、 統計方法
統計方法
Alleic frequency 定義為變異 alleles 的數目在所有 alleles 總數中表現的比例。
5HTR2A 基因型(genotype)和 allelic frequency 的多型性變異和不同的表現型
(phenotype)的組別相比較。我們使用統計軟體 SAS system 執行以卡方檢定和
Fisher’s exact test 分析類別變項。P 值定義為小於 0.05 為統計學上有意義。