第一節 研究材料 ㄧ、實驗動物準備
本研究以大白鼠（Sprague-Dawley rats）為實驗對象，其來源為 中華民國國家科學委員會國家實驗動物繁殖及研究中心，雌雄各 半。所有動物自購入後即飼養於中國醫藥大學動物中心，室內溫度 維持在 23℃，並保持固定光照週期（光-暗週期：各 12 小時），所 有大白鼠均飼養至年齡 9-11 週大，才開始進行實驗。所有大白鼠在 實驗前均不限制其日常飲食。實驗前三天所有實驗動物即被送至實 驗室以適應實驗室的環境。實驗前有15 分鐘穩定實驗動物生理狀況 並以溫度控制器維持實驗動物體溫( 37°C ± 0.5°C)直至實驗完成。
二、麻醉
以腹膜內注射 Citosol (25-40 mg/kg)，直到大白鼠被適當麻醉。
三、導管準備
以 Polyethylene tubes（PE-50）進行動靜脈插管，包括插入右頸 靜脈以作為輸液輸注之用，並以 Cardiomax -II model 85（Columbus Instruments International Co., Ohio, USA）監測中心靜脈壓。插入右 股動脈並以 Cardiomax -II model 85（Columbus Instruments
International Co., Ohio, USA）連續監測平均動脈壓。插入左股動脈 以作為抽血造成出血性休克及輸血急救之用。所有實驗動物在實驗 中均給予林格氏液輸注（10 毫升/公斤/小時），以補充體液喪失。
四、實驗分組
36 隻大白鼠被隨機分成三組，每組 12 隻，雌雄各半，每組再 分成雌雄兩次組：
第一組：控制組（只施行剖腹手術，Sham operation）
第二組：出血性休克組（剖腹手術＋出血性休克）
第三組：急救組（剖腹手術＋出血性休克＋輸血及輸液急救）
第二節 研究設計
ㄧ、出血性休克及急救模型
本 實 驗 所 採 用 出 血 性 休 克 模 型 是 使 用 固 定 血 壓 之 出 血
（fixed-pressure hemorrhage）。在第二組及第三組中，出血性休克 的誘發是以從左股動脈抽血，在十分鐘內讓平均動脈壓下降至 50+5 豪米汞柱，並以抽血及輸血方式維持此血壓 60 分鐘。休克維持 60 分鐘之後，第二組不給予急救；而第三組則給予輸血及輸液急救（原 抽血量均被完全輸回，並以兩倍於輸血 量之林格氏液輸注），急救 應於十分鐘內完成。第一組除了接受剖腹、動靜脈插管及給予基本 輸液外，在實驗期間並不給予誘發出課及急救。 急救期後，實驗動 物之動靜脈插管即予拔除，並將血管結紮，令其甦醒。四小時後所 有實驗動物均給予安樂死以進行抽血及取肝。
二、實驗步驟
時間（分） 0 15 25 85 95 Gr. I A B
Gr. II A B C D
Gr. III A B C D E
A1 B1 C1 E1 F1
A1： 開始準備實驗
A ： 準備期 (90 分鐘): 包括剖腹手術（從恥骨到劍突沿腹中線切 開老鼠腹部後, 立即將傷口縫合）、儀器準備及動靜脈插管, 完 成以上步驟後才開始計時。
B1： 實驗開始（開始計時）
B ： 穩定期 (15 分鐘) C1： 開始抽血
C ： 誘發出血性休克 (10 分鐘): 在 10 分鐘內, 從老鼠體內抽血(2.5 毫升/公斤體重), 平均動脈壓維持在 50+5 毫米汞柱
D ： 休克維持期（60 分鐘）：藉抽血或將血回輸維持平均動脈壓 在 50+5 毫米汞柱
E1： 開始急救：輸血及輸液 E ： 急救期（10 分鐘）：
1. 將抽出之血(2.5 毫升/公斤體重)輸回實驗動物血管內 2. 靜脈輸液(Lactated Ringer solution :5 毫升/公斤體重)
說明
1. 灰色區域代表上述各項(ABCD)執行期間 2. 空白區域代表此段期間不做任何動作
3. 在第 85 分鐘時三組實驗動物全部執行上述 E 之動作 時間（分）95 335
Gr. I F
Gr. II F
Gr. III F
F1 G1
F1：移除管路、結紮血管及縫合傷口。
F ：恢復期（4 小時）
G1：實驗開始後 4 小時（第 335 分鐘）以安樂死方式犧牲各次組老 鼠(各次組 6 隻), 並立即從死亡老鼠以心臟穿刺方式取得血液及 肝臟組織。恢復期期間若老鼠死亡，立即以上述方式取得血液及 肝臟組織以供研究。
三、血清收集與儲存
在老鼠被犧牲後即採用心臟穿刺的方式收集全血。並以含 EDTA 之試管收集血液並立即離心（速度：3000 轉/分，共 10 分鐘），
將上清液收集於抗凍離心管（1.5cc），再貯存於-70°C 冰箱中直至 分析。分析雌激素及細胞激素所使用的試劑簡述如下：
1. 17β-estradiol 血清濃度之分析是使用市售酵素連結免疫吸收分析 法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），其操作方法如 製造廠商所附的使用說明書(Cayman Chemical Company, USA )。
2. IL-1β, IL-6, IL-10 及 TNF-α 的血中活性也是以 ELISA 方式檢測，
其操作方法如製造廠商所附的使用說明書(R&D Systems, Inc, USA)。
四、肝臟組織取得與儲存 1. 肝臟組織取得步驟如下：
從恥骨到劍突沿腹中線切開老鼠腹部切下肝臟中葉一體節(重量
> 1 公克) , 並在中葉近端以 3-0 絲線結紮血管止血
2. 將肝臟組織至入標本瓶並迅速置入液態氮鋼瓶中，再送至-70oC 的冷凍庫中冷藏直到做微陣列（Microarray）分析。
五、微陣列技術 1. 介紹
本實驗是以GeneChip® Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix, Inc.，圖一)，運用微陣列技術來分析核糖核苷酸在肝組織的表現，
它可檢測超過三萬個基因。GeneChip® Rat Genome 230 2.0 Array 的 製造是結合photolithography 及 combinatorial chemistry 的技術而產稱 的 。 每 一 陣 列 上 （Array ） 有 高 達 130 × 106 不 同 寡 核 苷 酸
（Oligonucleotide）探針被合成。每個寡核苷酸均位陣列上稱做
「Probe cell」的特定區域。每個 probe cell 數十萬至百萬份特定寡 核苷酸拷貝。
在實驗操作過程中以 biotin 標記的 RNA 或 DNA 片段我們稱之 為「目標物」會被雜合至探針陣列上。被雜合的探針會以 streptavidin phycoerythrin conjugate 染 色 並 以 GeneChip® Scanner 3000 或 GeneArray® Scanner 掃描。 在 570 nm 波長光射出量正比於與每個 探針陣列結合的標的物的量 86-87。
本實驗共分三組，每組再分雌雄兩次組，因為經費限制每組雌 雄各選擇兩個肝臟組織標本（共12 個標本）進行 DNA 微陣列實驗。
2. GeneChip® 之操作及分析流程（圖二）
甲. 核醣核苷酸之準備（RNA preparation）
總 RNA 由 大 白 鼠 肝 組 織 標 本 被 萃 取 出 來 並 在 1%
agarose-formaldehyde 膠上跑電泳以決定 RNA 的完整性。所有 RNA 標本必須達到分析品質要求以確保能以最高品質的 RNA 來 做微陣列雜合實驗。總RNA 及以 biotin 標定的 cRNA 均須測定 其在 260nm 及 280nm 波長光吸收值（分別以 A260及 A280表示），
只有 A260∕A280 比值在 1.8 至 2.1 之間才符合標準。比值小於 1.8 代表蛋白質可能遭受污染；比值超過 2.1 則表示 RNA 可能變 質、truncated cRNA 轉錄本、或過多單獨核苷酸。總 RNA 通過 品質要求後才進行雙股 cDNA 的合成，接下來便是以 cDNA 為模
版在試管中進行轉錄（in vitro transcrirtion, IVT）反應來合成 cRNA。在進行雜合反應前 cRNA 會先被裂解成含 100 至 250 鹼 基對的片段。在 cDNA 合成後、cRNA 合成後及 cRNA 成片段後 均須以電泳來確保 cDNA、cRNA 及 cRNA 片段的品質以利雜合 的進行並獲致良好的實驗結果。
乙. 基因微陣列雜合（Gene microarray hybridization）
包含cRNA 片段（標的物）、probe array controls、BSA 及 herring sperm DNA 的雜合溶液會與探針陣列進行 16 小時的雜合反應。
丙. Fluidics Station Setup
在 PC 支援的工作站，使用 Affymetrix® Microarray Suite or GeneChip Operating Software (GCOS)來定義特定實驗資訊。探針 陣列形式、標本名稱及說明會先被輸入並以獨特的檔名存檔。完 成以上步驟並以適當緩衝液注入 fluidics station 後即準備進行洗 滌及染色。
丁. 探針陣列洗滌及染色
在完成雜合反應後便會在 fluidics station 上進行自動洗滌（去 除未雜合的 cRNA 片段）及染色。
戊. 探針陣列掃描
一旦探針陣列完成雜合、洗滌及染色，即開始進行掃描。每個 可執行 Affymetrix Microarray Suite 或 GCOS 軟體的工作站均控 制一個掃描器。軟體會定義 probe cells 並計算每個 cell 的強度。
每個完整的探針陣列影像會另以實驗名稱存成資料影像檔（.dat）
己. 資料分析
藉由資料影像檔（.dat image）來分析每個 cell 的強度（cell intensity data），其結果以.cel 存檔。由 cell 的強度資料可產生探 針強度資料，其結果以長條狀或圖形的格式來表示，並以.chp 存 檔。最後就可產生基因表現的初步資料。數據分析的資訊由 GeneChip® Expression Analysis: Data Analysis Fundamentals booklet (P/N 701190)提供。
3. 基因表現之比較
資料完成初步分析後，可利用 NetAffxTM Analysis Center
（www.affymetrix.com）、DNA-Chip Analyser（www.dchip.org）或 商用軟體系統 Genedata ExpressionistTM Pro 進行資料進一步探勘，包 括三組間基因表現差異的比較、表現基因的分群（Hierarchical
clustering）、Principal component analysis（PCA）及路徑探勘（Pathway exploration）。
第三節 統計方法
各組之間的比較是使用one-way analysis of variance (ANOVA) 統計方式分析。同一組不同時期血行動力學資料的比較則是以paired Student’s t- test 來分析。所有的數據均以平均值+標準差（Means +SD) 表示。 P 值<0.05 及表示有統計學上的意義。以上統計均使用市售 軟體 SPSS 第 13 版在電腦上執行。