研究方法(Research Methodology) - Item 987654321/19976

可包含實驗場域、研究對象、研究架構、資料蒐集方法與工具與分析方法等項目，但

生態、作物、經濟之影響(Fig. 7)，並以主題研究報告方式進行口頭與書面正式報告。<1-2>

實作與研習基礎植物組織培養理論課程與實驗技術，共有 15 個單元主題(Table 1)，包含：「1. 校已建置之「彰化師大雲端學院」之線上評量系統 (https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php)，

通過「線上評量」檢核後(Fig. 8)，將接著進行實作檢核「植物組織培養技術檢定」(Fig. 8)，

Fig. 7 次目標<1-1>探究課程以比較「永續農業」

與「慣行農法」之差異與優劣勢，擬探究主題。

Fig. 8 次目標<1-3>發展「線上評量」與「植物組 織培養技術檢定流程」，預計檢定項目與流程。

Table 1 次目標<1-2>實作與研習基礎植物組織培養理論課程與實驗技術。

單元單元名稱授課方式

簡報文件圖片影片網站其他

Introduction, grading, lab safety, sterile technique (組織培養無菌操作原理與安全)

V V V V

Sterilization of plant seeds (Arabidopsis, rice and tobacco plants)

(種子消毒與培植)

V V V V

Preparation and composition of nutrient media

(培養基配置與滅菌)

Preparation of medium containing hormones (植物荷爾蒙配製)

V V V

Mass micropropagation of healthy plants

(組織培養分生苗)

V V V

Induction of callus formation from rice embryo

(水稻癒傷組織誘導)

V V V V V

7 Somaclonal variation

(體細胞變異與分析) V V V V 8

Induction of callus from Arabidopsis hypocotyls (下胚軸癒傷組織誘導)

V V V

The regulation of hormones during organogenesis (荷爾蒙誘導器官再生)

V V V V

10 Subculture and shoot formation

(分生苗移瓶培養) V V V V

in vitro mutagenesis, anther culture, cryopreservation, suspension

(組培突變誘導技術)

V V V V

12 Selection of transgenic plants

(組培基因轉殖作物選殖) V V V V 13 Preparation of plant protoplast

(分離植物原生質體) V V V V 14

Root formation and

temperature sensitive mutant (溫度敏感突變株選殖)

V V V V

Generation of virus-free plantlets

(無病毒培植體培養)

V V V V

承接分項目標一，若學生通過「線上評量」與「植物組織培養技術檢定」二項評量檢定，表示學生具有足夠之知識與技術能力能進行更深入探究與實作課程用以研發增益作物生長與免疫之土壤益生菌，也就是下階段本計畫分項目標二：研發增益作物生長與免疫之土壤益生菌 並應用於永續農業：次目標為：<2-1>選殖與繼代增益作物生長與免疫之土壤益生菌，學生將 4 人為 1 組，分組進行，將已選定建立增益作物生長與免疫之益生菌之農耕土壤樣區 (生物學系實驗園等)，包含二處慣行農法區可作為本計畫之控制組與有機區，可為本計畫之增益作物生長與免疫之益生菌繼代選殖取樣區，選殖與繼代增益作物生長與免疫之益生菌工程 (engineering microbiomes)，利用「土壤菌相」與「作物生長」外表形態雙向策略(Fig. 9) ，首 先將番茄或小黃瓜分別種植於慣行與有機區土壤(Fig. 9-1)；接著 (Fig. 9-2)；2 周後選取具有 作物生長較佳之土壤菌相(Fig. 9-3)；將此作物生長較佳土壤菌相移植入新的滅菌土(Fig. 9-4)，

如此重複 4 次進行土壤菌相增殖、繼代選殖工程，最後不僅豐富(enrich)增益作物生長與免疫 之益生菌，也有助於後續專一性選殖土壤益生菌。；<2-2>分析益生菌之溶磷、固氮能力與增 益植物生長免疫效應，將模式植物阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)種在不同條件的礦物磷培養 基當中(Fig. 10)，加磷培養基為植物生長的理想條件，預期植株有正常生長。而三盤分別為缺 磷條件下的控制組、酵母菌控制組及溶磷酵母菌實驗組，另外盤分別為缺磷條件並補充磷酸氫鈣條件下的控制組、酵母菌控制組及溶磷酵母菌實驗組，固氮能力與增益植物生長免疫之 研究設計組別與益生菌之溶磷能力分析相同；<2-3>開發增益作物生長與免疫之益生菌製劑與 技轉，接著將學生探究與實作成果建置菌種資源庫與溶磷或固氮等益菌製劑。

Fig. 9 本計畫選殖與繼代增益作物生長與免疫之土 壤益生菌~增益小黃瓜與番茄生長為模式之流程圖。

Fig. 10 溶磷酵母菌及含礦物磷培養基之實 驗設計示意圖。

13 in rice (miRBase)

第1~6月 (一階段) 第7~12月 (二階段)

Life cycles: 40 days

建構永續農業導向之植物組織培養學探究實作課程

B.研究假設

本教學實踐研究計畫將檢驗探討此項假設：大學生物或農業相關系所之學生與教師可藉由「永 續農業導向之植物組織培養學探究實作課程模組」達成(1)教師能將個人研究(例如：植物學) 與培育學生連結；(2)學生能夠自行建構知識與運用所學習之技能應用於農業作物；(3)學生能 夠自主學習，創新研發，貼近產業所需，將依據本計畫各項評量系統「線上評量」、「植物組織培養技術檢定流程」與「研發增益作物生長與免疫之土壤益生菌」來檢驗此項假設。

C.研究範圍

本教學實踐研究計畫研究範圍為本校大學部課程與學生，課程規劃為系列性，首先進行第 1 項階段：建構永續農業導向之植物組織培養學探究實作課程，在進行實作檢核「植物組織培養技術檢定」，將以教師、助教、與預計邀集農業試驗所生物技術中心組織培養實驗室中陳威臣研究員以協作實踐方式共同執行檢核流程，並舉辦「植物組織培養技術檢定」工作坊，也開放產業或學術界有「植物組織培養技術檢定」相關需求人員一同來參與：在第 2 項階段目標：研發增益作物生長與免疫之土壤益生菌並應用於永續農業，將與本系「酵母菌演化生態研究室」周睿鈺副教授 (本計畫之共同主持人) 以協作實踐方式共同規劃課程藉由植物組織培養技術，建立增益作物生長與免疫之土壤益生菌選殖實驗系統，也將共同建立此評量系統。

D.研究對象

本課程將學習植物組織培養基本原理、實務技術、探究實作能力，本選修課程開設於大學四年級，也開放二、三年級同學進行選修，在修課前應具備「基礎生物學」、「植物解剖學」、「植物生理學」與「植物形態學」相關知識與修習相關課程，並了解植物激素之作用與生長發育之分子機制，才能順利進行本課學習。

E.研究方法及工具

第 1 項階段目標為：建構永續農業導向之植物組織培養學探究實作課程模組中，<1-3>發展「線上評量」與「植物組織培養技術檢定流程」以作為學生基礎「植物組織培養」知識評量策略 之一，將利用本校已建置之「彰化師大雲端學院」之線上評量系統 (Fig. 12)。

Fig. 12 本校已建置之「彰化師大雲端學院」之線上評量系統 (https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php)。

第 2 項階段目標為：研發增益作物生長與免疫之土壤益生菌並應用於永續農業之益生菌單一菌株分離：將採集到根際土壤分別放置在培養液 15 mL 試管中在攝氏 28℃下以旋轉震盪器震盪培養一天，接著塗在麥芽抽出物洋菜膠培養基培養數天 3~5 天，並將不同型態的益生菌選出，採用連續劃線分離培養法純化菌株，最後將各菌珠保菌於 YPD 培養基，加 15%甘油並存放在攝氏 80℃的環境保存。益生菌分類鑑定：利用 ITS （internal transcribed spacer）鑑定法將保存的益生菌進行分類，是指對 ITS 序列進行 DNA 定序，將得到的 ITS 序列與已知真菌 ITS 序列比較。益生菌溶磷能力分析：接著將益生菌接種於磷酸氫鈣(calcium hydrogen phosphate CaHPO4)礦物磷培養基中，培養於攝氏 28℃環境下 5 天。觀察菌落周圍是否有透明圈的出現，若透明圈直徑愈大表示溶磷能力愈佳，反之若無透明圈則表示沒有溶磷能力。溶磷酵母菌對於植物在含礦物磷培養基之生長影響：將阿拉伯芥種子以消毒水(5%次氯酸鈉與數滴界面活性劑 Tween-20)搖晃消毒 5 分鐘，再以無菌水搖晃清洗 1 分鐘並重複此步驟三次，

最後將消毒後種子播種於 MS medium 【Murashige and Skoog medium：1X MS salts (Sigma, St.

Louis, MO cat. no. M5519), 1% Sucrose, 0.5 g/L 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), 1.5% Bacto-agar pH=5.7】，阿拉伯芥種子播種於不同條件的植物培養基(MS medium)，磷酸氫鈣濃度為 0.05%，種好之後以石蠟帶將培養盤密封，植物缺磷時植株生長緩慢、矮小、莖細直立，分枝較少，葉小，呈暗綠或灰綠色而無光澤，莖葉常因積累花青素而帶紫紅色。根系發育差，易老化。針對上述外表型進行觀察與分析。鮮重：植物採集來後立刻測出的重量。

在本研究中，研究團隊已建立微生物分泌性物質對於植物之影響實驗系統(Fig. 13)，將阿拉伯 芥(Arabidopsis thaliana)種在不同條件的植物培養基(MS medium)當中：(A)加磷培養基為植物 生長的理想條件；(B-D)缺磷條件下植物生長情況不佳；(E-G)缺磷條件並補充磷酸氫鈣，初

4. 教學暨研究成果(Teaching and Research Outcomes)

(1)教學過程與成果

本計畫於 107 學年第二學期 (大四)植物組織培養學(2 學分)以及植物組織培養學實驗 (1 學分) 課程中執行共 12 位同學與 1 位助教，共有六項具體教學成果，分別為；A 成果: 探究討論 課程以比較永續農業與慣行農法之差異與優劣勢 (Fig. 14)；B 成果: 建構線上影音開放式課 程-植物組織培養理論與技術(https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php#2) (Figs. 15 and 16)；C 成果: 建構線上評量題庫與測驗-植物組織培養技術(https://dlearn.ncue.edu.tw/learn/index.php) (Fig. 17)；D 成果: 選殖與保種增益作物生長與免疫之土壤益生菌(Fig. 18)；E 成果: 分析益生 菌之溶磷、固氮能力與增益植物生長效應(Fig. 19)；F 成果: 開發增益作物生長與免疫之益生 菌製劑(Figs. 20 and 21)。

A 成果: 探究討論課程以比較永續農業與慣行農法之差異與優劣勢

B 成果: 建構線上影音開放式課程-植物組織培養理論與技術 Fig. 14 探究討論課程以比較永續農業與慣行農法之差異。

Fig. 15 建構線上影音開放式課程與彰師大雲端學院登入網址 (https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php#2)。

Fig. 16 建構線上影音開放式課程植物組織培養理論與技術與彰師大雲端學院登入網址 (https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php#2)，共建構 12 單元。

C 成果: 建構線上評量題庫與測驗-植物組織培養技術

D 成果: 選殖與保種增益作物生長與免疫之土壤益生菌 (a) (c)

(b)

Fig. 17 建構線上評量題庫與測驗 - 植物組織培養技術與彰師大雲端學院登入網址 (https://dlearn.ncue.edu.tw/mooc/index.php#2)，題庫共計 120 道題目，可隨機選題進行測驗。

Fig. 18 選殖與保種增益作物生長與免疫之土壤益生菌。 (a)溶磷酵母菌；(b) 溶磷酵母菌於不同濃度 磷酸之生長與溶磷透明圈分析；(c)固氮酵母菌。

E 成果: 分析益生菌之溶磷、固氮能力與增益植物生長效應 (a)

(b)

F 成果: 開發增益作物生長與免疫之益生菌製劑

Fig. 19 分析益生菌之溶磷、固氮能力與增益植物生長效應。(a)學生各組探究培養益生菌有 機資材配方；(b) 益生菌發酵液增益蔬菜萵苣植物生長效應。

Fig. 20 開發增益作物生長與免疫之益生菌製劑，課堂實作與特有生物 研究保育中心校外研習及同學成果發表。

(2)教師教學反思

本計畫已產出開放式課程影音教材、線上評量系統、植物組織培養技術檢定流程。並與本系周睿鈺副教授 (本計畫之共同主持人)進行跨領域合作，也已發表益生菌相關論文(Mycosphere 9: 1117–1131, SCI)，教學回饋分數為 4.96 分、是近三年來之最高分，前後測成績分別為 65 與 90 分，教師反思本教學實踐研究計畫成果將有助於學生自主學習，強化學習創新，培育植物學或農業生物科技產業人才。透過本教學實踐研究計畫成果已能夠：(1)將教師個人研究(例如：植物學)與培育學生連結；(2)引導學生將模式植物研究中所建構知識應用於農業；(3)培育出具備解決問題(例如：植物學或農業生物科技)能力的學生；(4)讓學生自主學習，強化學習創新，培育產業人才(例如：植物學或農業生物科技)，更重要的是所培育之學生能因應在

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