第一節 研究材料
一、 菌種及質體列於附錄一。
二、 藥品
本實驗中所使用的藥品及有機溶劑購自E. Merck, J. T. Backer Company, Sevrva Frvafeinrobiochemica, Boehringer mannhrim GmhH Biochemical, Pharmacia, Sigma Chemical Company, Biosolve 及日本和光藥物公司。
細 菌 培 養 基 使 用 的 藥 品 購 買 自 Difo Laboratories 和 Accumedia manufacturers, Inc.。抗生素藥品是向 Sigma Chemical Company，BBLTM 購買。限制酶以及其它酵素是購自TakaRa Shuzo Co. Ltd., New England Biolabs (NEB) 、promega company 和 Bethesda Research Laboratories 。 T4 DNA ligase 、DNA polymerase Ⅰ Klenow fragment 購買自 promega Co.。β-sitosterol 及 hesperetin 由林振文老師實驗室提供。結構列於圖十、
十一。
三、 引子
本實驗所使用的引子
(stock solution concentration 100 μM, working concentration 10μM)
5’-ACATTGCCTACTACACCTCC-3’
2. M13-R (20 mers)
5’-GGCTCGACTCTGTAAAGAGC-3’
3. Tc-F (18 mers)
5-CGTCAGGTGGCACTTTTC -3
4. Tc-R(19 mers)
5-GGCTTCCATTCAGGTCGAG-3
四、 培養基
本實驗中所使用的培養基配方是參照Sambrook et al. (1989)。
1. Luria-Bertaoni broth medium (LB)：其成分為每 1 公升水中含有 10g tryptone，5g 的 yeast extract 及 5g 的 NaCl。
2. Luria-Bertaoni agar (LA)：於 LB broth medium 中加入 1.5％ agar。
3. Mueller-Hinton agar(MHA): 其成分為每 1 公升水中含有 17.5g acid hydrolysate ofcasein ，2g 的 beef extract 及 17g 的 agar。
4. XOL medium：每公升的水中含有 0.7 克 K2HPO4 、0.2 克的 KH2PO4 、 1 克的(NH4)2SO4、 0.1 克的 MgCl26H2O、 0.1 克 FeSO47H2O 、及 0.001 克 MnCl2(pH7.0)。並外加適當濃度之醣類作為碳源。
5. XOLN medium：在 XOL medium 中，加入 0.0625％ yeast extract、
0.0625%tryptone，並外加適當濃度之醣類作為碳源。
五、 血清
1. 依標準抽血程序抽取健康人血液約20cc 將血液置於無凝固劑 的無菌試管中。
2. 將試管放置於室溫30min 後，以 3000rpm，5min 離心取上清液。
3. 將剩餘血清檢體保存於-20℃。
六、 試劑與緩衝溶液
1. 抽取質體 DNA 試劑
質體DNA 之抽取是依照 Birnboin ＆ Doly (1979) 所述之 alkaline method 修飾後進行。所需試劑如下：
（1） Solution Ⅰ：25 mM Tris HCl (pH 8.0)，10mM EDTA (pH8.0) 及 50 mM glucose。
（2） Solution Ⅱ ：0.2 N NaOH 及 1％ SDS。
（3） Solution Ⅲ ：3 M potassium acetate (pH4.8) 及 5 M glacial acetic acid。
2. DNA 電泳試劑
(1) 6× Loading dye：0.25％ (w/v) bromophenol blue，0.25
％(w/v)xylene cyanol 及 30％ (w/v) glycerol。
(2) 0.5× TAE running buffer：40 mM Tris-acetate (pH 8.0) 及 2 mM EDTA (pH 8.0)。
(3) Staining buffer：1mM EDTA (pH8.0)，10mg/ml EtBr，
100μl EtBr，100μl RNase A 及 150 ml 去離子水。
3. catechol 2,3-dioxygenease 活性測試所需試劑
（1） Potassium phosphate buffer, 0.1M pH7.5
Solution A : 27.2g KH2PO4‧H2O per liter(0.2M) Solution B : 34.9g K2HPO4‧H2O per liter(0.2M)
再以solution A 16 ml 加 solution B 84 ml, 後加去離子 水至 200 ml
（2） Assay buffer
取80 ml 0.1M pH7.5 potassium phosphate buffer 及 20 ml 10% acetone， 後加去離子水至 200 ml
（3）0.1M catechol
1.1g catechol 粉末溶至 100ml Assay buffer，使用其完全 溶解後，再保存於 4℃。
4.β-lactamase 活性測試所需試劑
（1）Sodium phosphate buffer, 0.1M pH7.0
Solution A : 27.6g NaH2PO4‧H2O per liter(0.2M) Solution B : 53.65g Na2HPO4‧7H2O per liter(0.2M) 再以solution A 39ml 加 solution B 61 ml, 後加去離子水 至 200 ml
（2）Potassium phosphate buffer, 0.1M pH7.0
Solution A : 27.2g KH2PO4‧H2O per liter(0.2M) Solution B : 34.9g K2HPO4‧H2O per liter(0.2M)
再以solution A 39 ml 加 solution B 61 ml, 後加去離子 水至 200 ml
（3） Nitrocefin
1 mg Nitrocefin 粉 末 溶 至 100μl dimethylsulfoxide (DMSO)，使用其完全溶解後，再加入 1.9 ml phosphate buffer 至 2ml，保存於-20℃。
（4） CENTA
25g CENTA粉末溶至46ml 50 mM Potassium phosphate
(pH 7.0)，使用其完全溶解後，再分裝0.8ml於eppendrof 中，保存於-20℃。
（5） Protein determination
Bio-Rad 200μl，Cell extract 20μl，去離子水 780μl，再以 OD 595nm 測試。
5. EDTA ，0.5M pH8.0
146.125g EDTA 及 67.41g NaOH 粉末溶至去離子水中 調整 pH 值為 8.0，總體積為 1L。
第四章 研究方法
第二節 實驗方法
一、菌種的培養與保存 1. 短期保存
將S
.
maltophilia 菌株培養於不含抗生素的固態培養中，放置於 37℃培養 箱培養一晚後，可放置4℃短暫保存 5~7 天，予以備用。2. 長期保存
將本實驗所用的菌株培養於含有合適抗生素濃度的液態培基中，37℃震 盪培養一晚，視菌種的生長速度，在對數期間（log phase）取 0.7ml 的 菌液加入0.3ml 87％無菌 glycerol，使細菌與甘油的比例為 3:1，混合均 勻存放於抗凍管中，並在管上貼上標籤註明編號、菌種名稱和製做日期，
存放於-80℃備用。
二、 質體之抽取
將含有質體之菌株培養於 3ml 液態培養基的小空瓶中，可視情況加入合 適濃度之抗生素，37℃震盪培養一晚，視菌種的生長速度，在對數期間
（log phase），分裝至 1.5ml eppendorf 中，以 8000rpm 5 分鐘離心，去 除上清液後加入 100ul solutionⅠ溶液，使菌體重新懸浮，置於室溫中 5
分鐘。再加入200 ul solutionⅡ 溫和上下倒置數次後，置於冰上 5 分鐘。
再加入 150ul solutionⅢ上下倒置數次後再置於冰上 10 分鐘。接著以 12000rpm 10 分鐘離心，取上清液至另一新的 eppendorf 中以 1 比 1 比例 加入phenol/chloroform 混合均勻以 12000rpm 5 分鐘離心後取上清液至另 一eppendorf 中，重複數次使界層無雜質後再加入等量 chloroform 混合均 勻，12000rpm 5 分鐘離心，取上清液至另一 eppendorf 中加入二倍體積 95％酒精，混合均勻置於冰上 10 分鐘後，再以 12000rpm 10 分鐘離心，
去除酒精得沉澱質體 DNA，等酒精揮發乾後回溶適當無菌水中儲存於 4
℃或-20℃備用。
三、 洋菜膠體電泳分析
取洋菜粉(agarose)加熱溶於 0.5 倍的 TAE 電泳緩衝液中，配置成 0.8
％或1.0％的膠體後，待膠體冷卻至 50-60℃時，倒入鑄膠槽中並插上齒 梳(comb)。待洋菜膠體冷卻凝固後，拔掉齒梳，將樣品 DNA 與 1/6 體 積的6 倍的 loading dye 混合均勻後，加入膠體之溝槽中，並於同一片膠 體的另ㄧ溝槽中注入適量之1kb DNA marker 作為對照，以 50 或 100 伏 特通電經適量時間後，取出膠體，將其浸泡於含 0.5μg/ml ethidium bromide(EtBr)之水溶液中經適當時間後再將膠體取出以去離子水退染 3-5 分鐘，置於 UV 燈下觀察並照相。可藉由與 DNA marker 已知的片
段的量與分子大小。
五、DNA 片段回收
DNA 片段回收使用 GeneMark DNA Clean/Extraction Kit，將要分離的 DNA 片段以洋菜膠體電泳分離，於 EtBr 染色 10 分鐘，置於紫外線箱上 觀查，使用刀片切取欲回收 DNA 片段的膠體，分裝至 eppendorf 中，加 入 500-700 ul Binding solution，置於乾浴機 65℃加熱 30 分鐘，時而上 下倒置搖晃，待膠體完全溶解後，再吸取溶液至Kit 提供的 Spin column 中，下接Collection column，以 12000rpm 3 分鐘，再加入 500ul Washing Solution 12000rpm 5 分鐘，重複二次，打開 Spin column 蓋子待酒精揮 發後，再視情況加入適量無菌水於Spin column 中，於室溫作用數分鐘後，
以12000rpm 離心 10 分鐘，即得回收產物，置於 4℃備用。
六、限制酶切割
利用限制酶可辨認特定序列的特性，將DNA 與所需要的一至兩種限制酶 及配合廠商建議的緩衝溶液混合，以及廠商所建議限制酶的反應溫度，
進行DNA 切割反應，反應時的 DNA 濃度約為 1ug/50ul，反應時間視選 擇限制酶的種類而調整，完成後再以洋菜膠體電泳分析切割情形。
七、DNA 片段之黏合反應
將所選擇的載體經限制酶切割後，再與需接黏的DNA 片段以適當比例混 合均勻，並加入1ul T4 黏接酶及廠商建議的緩衝溶液，最後用無菌水補 齊體積為20ul，混合均勻，置於 16℃下作用 12-16 小時，即完成連接作 用(Ligation)。
八、 E coli DH5α勝任細胞（competent cell）之備製
先將隔夜培養的E coli DH5α 菌液以合適比例接種至 40ml 液態培養基 中，37℃震盪培養至 OD600 0.5-1.0，將菌液以 4℃,8000rpm 離心 10 分 鐘，去除上清液，再加入20ml 100mM CaCl2 混合，置於冰上 30 分鐘，
再以4℃ 8000rpm 離心 10 分後，去除上清液，再以 100mM CaCl2 回溶 至適當的濃度，使菌種懸浮於其中就成為勝任細胞即可使用，未使用之 勝任細胞可至於4℃中備用。
九、E coli DH5α之轉形作用
取適量 DNA 或質體加入 100ul 勝任細胞，置於冰上作用 10 分鐘後，再 置於42℃水浴槽中進行熱休克(heat shock)反應 2 分鐘，再快速移回冰上 再作用 2 分鐘，再加入 500ul 液態培養基，37℃震盪培養約 2 小時，再 8000rpm 5 分鐘離心，最後再塗於含有篩選抗生素的固態培養基上。37
℃ 隔 夜 培 養 。 如 果 質 體 帶 有 β -galactosidase 基 因 ， 則 視 所 需 加 入 IPTG(0.8mg/ml)及 X-gal(0.8mg/ml)以進行藍白篩選。
十、質體快速篩檢法
使用已滅菌的牙籤挑選各個單一的轉形菌株，分別接種於含有合適抗生 素1m 的液態培養基中，37℃震盪培養 6-8 小時，以 12000rpm 離心 5 分 鐘，去除上清液，加入含有20ul 1％SDS 的 loading dye，劇烈震盪使沉 澱物完全打散，再各加入等體積的 phenol/chloroform，混合均勻後，以 12000rpm 10 分鐘離心，吸取 10ul 上層液進行洋菜膠電泳分析，並將僅 含有載體的菌株以上述同樣方法注入同一洋菜膠體中，做為對照組。
十一、聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)
取 5ul 的染色體或 DNA 片段當作模板，加入 5ul 的 1.25mM dNTPs (dATP、dTTP、dGTP、dCTP)，加入 10X Taq DNA polymerase buffer 5ul，
再個別加入適當引子5ul，DMSO 5ul 和 1ul 的 polymerase，最後加無菌 水至 50ul。均勻混合後，再視條件設定反應所需的循環溫度，最後完成 PCR 產物置於 4℃備用。
十二、破菌法:
1. 超音波破菌法(sonocator)
將隔夜培養的菌液以OD550 0.2 接種至 20ml 液態培養基中，37℃震盪培 養至 OD550 0.7~0.8，加入抗生素(inducer)或不加抗生素(no inducer)誘 導，在誘導的時間後，將菌液裝於 50 ml 的離心管，將菌體離心 12000 rpm(5~15 分鐘)，用 0.33 M NaOH 當做緩衝濃液洗菌三次，再將菌體離 心12000 rpm (5~15 分鐘)將菌體上清液倒去。將菌體以適當的緩衝溶液 (Sodium phosphate 或 Tris-HCl) 回溶 2 ml，將菌體劇烈搖晃倒菌體散開，
將菌液置於冰上並將破菌的探針插入菌液液面下破菌，破菌條件為 2.5 W，10 分鐘(打 10 秒停 10 秒)，破完菌後，將菌液以 12000 rpm 離心 20 分鐘，收上清液。
2.外膜破菌收蛋白法(Lysozyme):
將隔夜培養的菌液以OD550 0.2 接種至 20ml 液態培養基中，37℃震盪培 養至OD550 0.7~0.8，並用抗生素給予誘導反應後，再以 8000rpm 5 分鐘 離心，取pellet，加入 2ml 0.33M NaCl 使菌體重新懸浮，以 8000rpm 5 分鐘離心，重複三次上步驟，加入 1.2ml(含 1mM EDTA，1mg/ml lysozyme，20% sucrose/30mM Tris-HCl(pH8.0)) 回溶，置冰上作用 1 小時。再以12000rpm 離心 30 分，取上清液分裝至 eppendorf 中，保存於 -80℃中備用。
十五、抗生素感受性試驗
1. 抗生素培養基之配製
本實驗抗藥性測試的方法主要是依照agar dilution method。
泡製2 倍數系列稀釋的抗生素濃度的 Mueller-Hinton 培養基。
所使用的抗生素包括：pencillin 類抗生素 (如 carbenicillin, piperacillin、
amoxicillin、ticarcillin、piperacillin)、clavulanate、aztreonam、trimethoprim、
sulfamethoxazole 泡製的濃度為 2-256μg/ml。
2. 將隔夜新鮮培養，濁度為 0.5 McFarland 的菌液稀釋 3 倍，以 multipoint inoculator 接種至含有不同濃度抗生素的 Mueller-Hinton 培養 基上，使得每一接種點有 104的菌落數(104/spot)，以 E
.
coli DH5α菌 株做為為陰性對照組，培養於37℃培養箱中，24 小時後觀察並紀錄其生 長情形。3. Synergy 及 antagonism 的定義
對一菌株而言，若該菌株進行抗藥性感受性試驗，對 β-lactam/inhibitor 所表現之 MIC 與對單一該 β-lactam 所表現之 MIC 的比值 (MIC β-lactam/inhibitor/MIC β-lactam) ≦2 時，定義為 Synergy;若此比值 2 時定義為antagonism。(Lecso-Bornet M ＆ Bergogne-Bérézin E，1997)
十六、生長曲線測定
將待測之菌株培養於 LB 或 XOLN 液體培養基培養隔夜，取些許液體培 養基懸浮菌體以適當濃度在 OD450中測其吸光值，將菌液接種至新鮮 LB 或 XOLN 液體培養基中，調整菌液起始濃度使其 OD450 之吸光值為 0.3-O.35 之間，置於 37℃培養箱震盪培養，每隔 30min 取出菌液，每株 分析樣本皆取樣兩份，測其OD450吸光值。
十七、catechol-2,3-dioxygenase 酵素活性分析
將菌液的起始濃度OD450調整為0.3-O.35 之間，加入依實驗需求不同之 條件變化，置於37℃培養箱震盪培養。約培養 40-60 min 後加入不同濃 度的抗生素或藥品試劑後，繼續培養依不同時間收菌液，每次所收取的 菌液皆為 1 ml，以 8000 rpm，5 min 離心去除上清液，回溶於 1 ml 的 C230 assay buffer 中，調適當反應濃度後 置於石英管中以 OD375先Blank
將菌液的起始濃度OD450調整為0.3-O.35 之間，加入依實驗需求不同之 條件變化，置於37℃培養箱震盪培養。約培養 40-60 min 後加入不同濃 度的抗生素或藥品試劑後，繼續培養依不同時間收菌液，每次所收取的 菌液皆為 1 ml，以 8000 rpm，5 min 離心去除上清液，回溶於 1 ml 的 C230 assay buffer 中，調適當反應濃度後 置於石英管中以 OD375先Blank