第 一 節 研究材料
第一項 非小細胞肺癌組織的取得與製備
從 2002 年 7 月到 2002 年 12 月之間，我們實驗室選擇了 11 位屬於 非小細胞肺癌的肺腺癌（Adenocarcinomas）病人的組織切片作為研究 材料。這些組織切片，都是在肺癌手術切除時，從病人的腺癌組織中 切取約半公分見方的樣本，裝瓶封口後，直接投入零下-70℃的液態氮 桶中冰存；另外我們在病人取下的肺癌標本中，在同一個肺葉標本的 正常肺臟周邊肺組織部分，切取同樣半公分見方的樣本，也同樣立即 冰存在液態氮桶中。而所有的組織標本都經由臨床病理醫師的檢驗 後，確定病人的惡性腫瘤全為肺腺癌，並確認病人被取下的正常肺部 分組織裏，沒有證據顯示惡性腫瘤的侵犯。而以上病人的組織樣本收 集，在手術切除前，都經由病人填具同意書，表示知曉並願意接受組 織樣本之捐贈以及處理。
我們首先從其中五個肺癌病人的腫瘤組織中，依照 Clontech 公司 出產的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 的步驟操作，建構向前
（forward subtraction）以及向後扣減（backward subtraction）雜 交的 cDNA 基因庫。接著應用生物晶片技術，同時篩檢千百個基因。最 後將挑選出來的特別差異表現的基因，以 RT-PCR 在所有 11 個肺腺癌 病人的組織中做半定量的表現程度偵測。另外並以 Met 基因的抗體在
43 個非小細胞肺癌組織中進行螢光原位雜交免疫組織染色（FISH）。結 果計算 FISH 陽性率的方法則 依我們研究團隊先前發表在 Cancer Research 上，有關非小細胞肺癌中 Dihydrodiol Dehydrogenase 過度 表現文章中所使用的技巧，來對組織螢光染色的呈色情形作半定量的 分析比較（18）。再結合以上肺癌病人的臨床病理資料等，以 χ2（卡 方檢定）進一步做為統計上的分析研究。
第二項 萃取肺組織中 mRNA 的步驟
取適當大小之零下－70℃液態氮儲存的手術後冰存之肺癌標本及 同一病患取下之相對正常肺組織，置於研缽中磨碎，以 SNAP RNA column
（Invitrogen, San Diego, CA. USA）及氯仿 (chloroform )，將 RNA 萃取出來。這時候注意要全程戴手套處理，避免污染造成 RNA 或是 cDNA 被 Nucleases 所崩解(degradation)。而切記高純度的 polyA+ RNA 才能 合成高品質的 cDNA。
萃取出之 total RNA 以及 polyA+ RNA 先以 1% 的 formaldehyde denaturing agarose/EtBr gel 跑電泳（electrophoresis）來確定萃 取出來的 RNA 含量以及品質。一般哺乳類動物的 RNA 會出現核醣體的 28S 和 18S RNA 兩條典型的亮條紋，分別位於 4.5 kb 以及 1.9 kb 附 近，同時並以紫外線光譜儀（ultraviolet spectrophotometry）測定 RNA 在 260nm 和 280nm 的吸光值，兩者比率應該約在 1.5-2.5:1 之間。
純度不高的 RNA 將會導致扣減雜交後的背景雜值太高，應該儘量避免。
第 二 節 實驗方法
整個 SSH 的實驗方法乃是使用 CLONTECH 公司所出的「C1ontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit」（Clontech Lab., Inc.）來進行 實驗。並且依照其使用手冊及注意事項逐一操作，步驟描述如下：
第一項 合成 first-strand cDNA
分別從 tester, driver 以及對照組 Control PolyA+ RNA(from human skeletal muscle) 各 取 2μg 的 PolyA+ RNA 作 為 模 板
（template），藉由 1μl (10μM) 的 cDNA Synthesis Primer 為引子，
以 AMV(Avian Myeloblastosis Virus) reverse transcriptase 反轉 錄? 加入 5X First-Strand Buffer、dNTP Mix 補水，加熱至 42℃作 用 1.5 小時來合成單股 cDNA。
第二項 合成 second-strand cDNA
取 上 述 合 成 first-strand cDNA 之 各 組 試 管 ， 分 別 加 入 5X Second-Strand Buffer、dNTP Mix、20X Second-Strand Enzyme Cocktail 混合後靜置於 16℃兩個小時。再加入 2 μl的 T4 DNA Polymerase 於 16℃
下反應半小時來複製 second-strand cDNA，然後加入 4μl 的 20X EDTA/Glycogen Mix 來終止製程。這時以 100 μl的 phenol : chloroform : isoamyl alcohol(25:24:1)搖勻後離心至 14,000 轉 10 分鐘，將上清 液小心到入 0.5 ml 離心試管中。再加入 100 μl的 chloroform : isoamyl alcohol(24:1)重複離心後以 ethanol 沉澱出 cDNA。最後以 PCR 的方
式，運用 SMART PCR cDNA Synthesis Kit（Clontech）來產生雙股 cDNA。
第三項 以 RsaI 切割核酸片段
我們依照前面所描述的方法，分別來製備測試者 cDNA 溶液以及驅 趕者的 cDNA 溶液。這邊所謂的測試者溶液，指的是以病人腫瘤組織為 來源，萃取它的 RNA 然後依照前面所描述的步驟，反轉錄成 cDNA 所製 備而成的雙股 cDNA 溶液；同樣的，從病人相對的正常肺組織所萃取 RNA，反轉錄成 cDNA 所製備而成的溶液我們稱為驅趕者溶液。在這裡，
我們分別從各個製備的溶液中取出 43.5 μl的雙股 cDNA 溶液，然後加 入 1.5 μl 的 RsaI 核酸限制? 酵素和 5.0 μl 10X RsaI Restriction Buffer 將雙股核酸序列分解成核酸片斷。這個步驟我們利用一個特殊 的限制? 酵素－RsaI，將 cDNA 切割成較小的片段，並將 cDNA 的末端 切割成 blunt-end，以便將來順利進行扣減雜交反應時，可以依此與接 合器進行黏合(ligation)作用。然後我們將已經經過限制脢消化分解 成片段以後的測試者溶液平均分配成兩部分。
第四項 黏合 Adaptor
在黏合接合器的過程中，我們將平均分配成兩個部分的測試者 cDNA 溶液，分別加入接合器 1 以及接合器 2R。並且將它加入黏合反應緩衝 液(2μl 5X Ligation Buffer and 1μl T4 DNA ligase)充分混合以後，
置 於 16℃後過夜反應 。這樣的黏合反應最後在加入 1 μl EDTA glycogen 混和均勻後終止反應。同時我們將它加熱到攝氏 72℃，持續
5 分鐘來使黏合酵素(ligase)去活化。之後稍微離心，並以-20℃保存。
注意只有 tester 的 cDNA 才要與 adaptor 進行 ligation 作用，而 driver 的 cDNA 則不需要和 adaptor 進行 ligation 作用。
第五項 第一次雜合反應(First Hybridization)
第一次的雜合反應前，應該先測試接合器(adaptor)黏合的效率如 何，否則必須要再重複上一個步驟，以免影響結果。操作時分成兩個 實驗組，由佔有絕對濃度優勢(excess)的驅趕者 cDNA 溶液，將它分別 倒入之前所製備的測試者 cDNA 溶液當中。（已經分別接上接合器 1 以 及接合器 2R），倒入 4X Hybridization Buffer，然後我們將溫度升高 到 98℃持續 1 分半鐘來達成解離變質(denatured)成單股 cDNA 的效 果。接著將溫度降到 68℃持續 8 個小時之久(不能超過 12 小時)，來使 雜合的緩衝液可以充分進行雜合反應。這時溶液中的單股 cDNA 也就是 具有差異表現的基因片段，將可因為雜合而產生明顯的相對濃度增強 作用(enrichment)。
第六項 第二次的雜合反應
第二次的雜合反應，乃是將先前所分別進行第一次雜合反應的 Adaptor1-ligated Tester1 和 Adaptor2R-ligated Tester2 兩種溶液 混合在一起，另外再加入一些新鮮的驅趕者 cDNA 溶液後，使之前描述 的增強作用更加明顯。不必要再經過特別的變質(denatured)過程，也 不需移除雜合物，將溫度控制在 68℃置放過夜使其反應均勻完全。最
後置於-20℃保存，此即為已扣減成功的 cDNA 溶液。
第七項 PCR 增強放大
有關於聚合? 連鎖反應，在整個實驗當中，總共必須進行了兩次循 環。分為 primary PCR 和 secondary PCR，第一次 PCR 先將產物複製出 來，增加其專一性，第二次 PCR 再進一步地抑制背景值而且再一次地 增強產物。我們在每一次雜合作用以後都進行一次 PCR 的反應。而初 次的 PCR 是用來篩選並增強那些含有差異表現的基因序列，只有那些 兩端具有不同接合器的雙股 cDNA，才可以經由 PCR 指數性的放大而被 篩 選 出 來 。 而 整 個 PCR 的 作 用 是 使 用 一 個 熱 循 環 器 (Thermal cycler(Perkin Elmer 480)。設定如下：75℃作用 7 分鐘(使 primer 可以接上 adaptor)，然後依照以下的設定做 30 個循環，包括 94℃反 應 30 秒，68℃反應 30 秒以及 72℃反應 1 分半鐘。最後再以 72℃ 5 分鐘最終延長。然後置於?20℃保存。
第八項 生物晶片雜合染色(Microarray hybridization)
所謂生物晶片是一個嶄新發展出來的技術，它允許我們在同一次的 檢測當中，利用精密的機器操作以及結合電腦強大的運算能力，可以 同時在 2 英吋見方的範圍大小，同時解讀超過 10,000 個基因的表現情 形，是解讀未知基因的一個強大工具。藉由這樣的過程，我們甚至可 以免除轉殖、選株、聚合脢連鎖反應放大，還有墨點試驗的種種過程。
不僅可以節省人力時間成本而且可以快速簡便提早獲得實驗的結果。
在實驗中，我們先使用前面步驟所描述的細節，來製備病人腫瘤組織 以及正常肺組織的抑制性扣減後 cDNA 基因庫溶液，就可以用來與鑲嵌 在生物晶片上的 cDNA 作雜合反應。而由於雜合後的染色反應，在透過 電腦強大的辨識力以及運算能力處理後，可以快速有效的獲得全部差 異表現基因的資訊。結果可以是生物晶片規則排列的呈色圖譜、可以 是基因分佈的座標圖、也可以是已知基因序列的豐富資訊，提供全面 的差異表現基因的大概。而如果比對後仍沒有特定已知基因的序列，
則可能是一個嶄新的基因表現（Novel gene），適合經過轉殖、複製、
定序、墨點試驗或是製作抗體進行原位染色來確認。相信那將會是更 令吾人感興趣而有意義的發現，或許會有意想不到收穫。
第九項 以 RT-PCR 確認並偵測表現程度
最後我們為了進一步確定所偵測挑選出來的差異表現的基因來自 於測試者製備溶液，在經過核酸限制? 的切割，扣減雜交的增強，以 及聚合? 連鎖反應放大以後是不是會有基因片段的遺失或是偽陽性的 產生。於是我們依所選定的 3 個特定基因 Tankyrase-1、Met 和 Decorin 的核酸序列，分別設計 5'端以及 3'端的 Primer，將它應用在 11 個非 小細胞肺癌病人的組織製備萃取液裏，用來進一步確定，並且做半定 量(semi-quantitative)的偵測，以確定該基因在組織當中的差異表現 情形。
第十項 以 Met 基因的抗體行螢光原位雜交免疫組織染色
最後，回到臨床病理機轉的探討上，我們選用 Met 基因的抗體在 43 個非小細胞肺癌的組織中進行螢光原位雜交免疫組織染色（FISH）。
這時候，正常肺組織的螢光染色結果被當成陰性對照組（negative control）。而反應結果的玻片（slide）則分別由兩位不知道有關組織 臨床病理資料的情形下的不同觀察者獨立判斷。通常以超過百分之十 以上的腫瘤細胞被染色為陽性，反之則為陰性。最後，將以上肺癌病 人腫瘤組織的螢光原位雜交免疫組織染色結果與一些臨床病理的變數
這時候，正常肺組織的螢光染色結果被當成陰性對照組（negative control）。而反應結果的玻片（slide）則分別由兩位不知道有關組織 臨床病理資料的情形下的不同觀察者獨立判斷。通常以超過百分之十 以上的腫瘤細胞被染色為陽性，反之則為陰性。最後，將以上肺癌病 人腫瘤組織的螢光原位雜交免疫組織染色結果與一些臨床病理的變數