第 一 節 抑制性扣減雜交的效力 第一項 扣減雜交的增強作用
如圖七所示，我們分別將扣減雜交反應之前、之後使用 PCR 複製放 大溶液中的核酸片段，發現在扣減雜交作用後 ，無論是向前扣減
（forward subtraction）抑或是向後扣減（backward subtraction）
都呈現出特定序列的專一性放大效果，而明亮的條紋則隨扣減雜交後 明顯變少，此即是 SH 的增強以及降低背景干擾的作用。
第二項 PCR 複製放大所需的循環次數測試
如圖八所示，在實驗操作中最後的 PCR 複製放大作用，讓我們可以 將特定的差異表現基因突顯出來，同時抑制其他沒有接合器附著的非 特定核酸片段（PCR suppression）。然而跑 PCR 的過程到底需要多少 次循環才適當，則需要進一步作滴定。一般大概要三十次左右，才可 以達到特定放大又能避免其他雜值的干擾。本實驗測試結果如圖八，
在 29 次時即達明顯之效果，但超過 35 次以上便又開始出現背景干擾。
第 二 節 肺癌組織中的差異表現基因分佈
如圖十、十一所示，我們分別將含有腫瘤組織萃取製備的測試者溶 液和含有正常組織的驅趕者溶液作扣減雜交稱為 forward
subtraction，相反的若是將前兩者的角色對調，以正常組織來扣減腫
瘤組織的話便是 backward subtraction。如此可分別篩選出腫瘤或是 正常組織中的差異表現基因，也可以作為一種自我檢測目的，減少偽 陽性產生的機會。本實驗依前述分別進行扣減雜交後，使用生物晶片 作快速之基因篩檢動作，得出如圖十之生物晶片經過雜交染色後之呈 像情形；以及如圖十一之扣減後基因分佈的座標圖。大抵上，在腫瘤 組織中過度差異表現的基因，可能與疾病的生成有關，類似致癌基因；
而相對的在正常組織中高度表現的基因，就可能與抵抗疾病有關，類 似一般所謂的腫瘤抑制基因。
第 三 節 抑制性扣減雜交後的肺癌特定基因
如圖九所示，本實驗結合抑制性扣減雜交反應和生物晶片雜交染色 技術，可以在 5 位非小細胞肺癌的組織切片萃取製備溶液中，發現至 少三個具有臨床意義的差異表現基因。他們分別是在腫瘤組織裡頭過 度表現的 Tankyrase-1 和 Met 基因；以及在正常組織表現較為明顯的 Decorin。
第一項 Tankyrase-1
Tankyrase-1 指 的 是 TRF1-interacting ANKYrin-related ADP- ribose polymerase 是位於端粒（Telomere）附近的特殊蛋白質（圖十 三）。近來被發現廣泛存在於人類的惡性腫瘤組織當中，它可以促進端 粒脢(telomerase)的作用來延長端粒的長度，使得腫瘤細胞不會受限 於細胞分裂時鐘（Mitotic clock）的限制，可以繼續存活下來。而其
作用的機轉是藉由與端粒脢抑制因子 TRF1 的結合來協同端粒? 的作 用，結果可以正向控制延長端粒的長度（43）。
Tankyrase-1，原意就是 TRF1 的結合蛋白質，擁有 24 個重複序列 的 ankyrin(ANK)，可以調節蛋白質與蛋白質之間的交互作用的特殊構 造。Tankyrase-1 就是用中間這些重複序列的 Ankyrin 來結合 TRF1
（44）。總結來說，Tankyrase 可以促進 TRF1 從端粒結合的 DNA 上掉落 下來，然而端粒的延長則需要 Tankyrase-1 尾部 PARP 功能區域的催化 反應。但是這樣的反應如果在於沒有端粒? 活性的細胞當中也不會發 生。由此看來，TRF1，Tankyrase-1，以及端粒? 三者共同存在交互作 用，缺一不可。可以廣泛的在人類的各種組織細胞裏頭找到它的存在
（45）。
近年來發現在大約 85% 的全部人類腫瘤和腫瘤衍生而來的細胞株 中，發現含有端粒脢活性。然而相反地在很多的正常體細胞(somatic cell)中，並沒有端粒? 活性的存在。因此，根據近年來研究的成果顯 示端粒? 極可能在哺乳動物細胞的腫瘤形成(tumorigenesis)及癌化 (carcinogenesis)過程和細胞老化的進行過程(aging)，扮演了一個很 重要的角色，希望能夠更進一步地去研究端粒脢基因的調控機制，透 過抑制端粒? 的表現或活性，而發展出有效的抗癌療法（46）。
第二項 Met(HGF receptor)
Met 是一種鑲箝在細胞膜的氨基酸磷酸? (Tyrosine Kinase)的接
受體，鍵結物就是 HGF（47），它可以刺激 Met 接受體而導致一連串的 增殖、延長細胞的生命、改變細胞的活動力、它被認為可以刺激腫瘤 的生成以及局部侵犯的生長移動等等，我們可以在很多實質的腫瘤發 現它有過度活化表現的跡象，是一種原生性致癌因子（48）。一般來講 我們可以在正常肺臟以及肺癌細胞當中找到它的存在；而 HGF 絕大部 分是在非小細胞肺癌裏頭表現，如此的結果顯示出對於非小細胞肺癌 來說，它扮演著一種自體內分泌回饋機制的循環刺激（49）。而臨床上 高濃度的 HGF 通常伴隨著比較差的預後，對於可以切除的非小細胞肺 癌來說，它事實上代表著一種比較惡性的預後，包含惡性腫瘤的局部 侵犯和遠處轉移的能力兩部分（50）。
第三項 Decorin
Decorin 是在 1986 年由 Krusius 和他的同伴所發現的（圖十六），
是一種富含白胺酸(Leucine) 的醣蛋白（proteoglycan）原生型，它 位於細胞膜表面的基質當中，承接一些外來的訊息傳導因子，調整或 啟動無數重要的生物活性，在腫瘤細胞的生長、轉移、侵犯上有著及 其重要的角色（51）。可以藉由和上皮生長因子的接受體（EGF receptor）
結合產生交互作用而激發出一個訊息路徑，導致生長的遲滯（52）。另 外如影響細胞外基質的整合或是結合膜上的胺基酸的磷酸脢來參與細 胞一些關鍵的生理步驟（53）。我們也可以把 Decorin 想像是一種可以 引起特殊訊息傳遞系統的一種對抗致癌因子的蛋白質、允許整個系統
反應來讓細胞可以清楚知覺到在細胞膜外微細環境中的變化同時可以 對於這些刺激作出反應（圖十七）。而細胞外基質裏頭的醣蛋白即扮演 這種角色，他們不只可以調控生長因子的活性同時另外也提供一種生 理以及生物活性的自然障礙來將惡性腫瘤細胞摒除在外（54）。因此，
腫瘤細胞侵犯的組織附近，通常可以發現有 Decorin 的表現增加的情 形，我們認為這個即是 Decorin 因應外在環境的調整，增加它的表現 以用來對抗腫瘤細胞的一個現象（55）。也就是說，它扮演著一種類似 自體分泌系統的調節機制來抑制生長。Decorin 可以經由直接刺激 p21 來影響以及改變整個細胞生命週期。p 21 是一種強力的 CDK 抑制劑
（56）。已經有實驗證實，假若我們將基因中的 Decorin 基因去除同時 加上腫瘤抑制因子 P53 的去除，則我們發現將會加速腫瘤的生成（57）。
第 四 節 Met 基因的螢光原位雜交免疫組織染色
我們運用 Met 基因的抗體在 43 位非小細胞肺癌進行的螢光原位雜 交免疫組織染色結果如圖十二所示。另外再將組織螢光染色的結果與 一些臨床病理的變數，包括性別、年齡、抽煙與否、組織學差異、分 化情形、有無復發或轉移等，列表並作卡方檢定（χ2 test）的統計分 析如表四。
結果我們發現以螢光原位雜交免疫組織染色方法偵測 Met 基因在 非小細胞肺癌細胞的分佈情形，其過度表現的陽性比率大約在 84%
（37/43）左右。而其結果與一些選定的臨床病理變數之間，在本研究 中則似乎沒有明顯的相對關係（p = 0.05）。如表四所列，在所有臨床 病理因子的卡方檢定下，僅有組織學（Histology）的不同，即病人之 肺癌究竟為肺腺癌或是鱗狀上皮癌的這個變數，可能會對於 Met 基因 在肺癌中的表現程度有所影響（p = 0.20），其餘之變數則都不具有統 計上有意義之差異。這一點跟許多已經發表的有關 Met 基因對於惡性 腫瘤的影響方面，主要在惡性程度（high grade of malignancy）以 及容易轉移（metastasis）兩方面有所不同。