第一節 研究架構
本實驗將從三方面去探討：（一）首先探討花生四烯酸對於不同 的乳癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、BT-474 生長情形的影響。（二）
分析經由花生四烯酸處理後，細胞週期的變化情形。（三）找出影響 乳癌細胞生長的機制，分析經花生四烯酸活化後，PPARα蛋白質與其 它細胞週期相關調節蛋白表現情形。
第二節 研究設計
本實驗首先要探討的是花生四烯酸是否會刺激乳癌細胞生長，並 找出刺激癌細胞生長的最有效濃度。實驗設計為以不同濃度的花生四 烯酸處理細胞後，在不同的時間點計數細胞的數目，並選出一個最有 效刺激生長的濃度作為之後的實驗使用，並訂定一個時間範圍，以作 為觀察時間的參考。為了驗證花生四烯酸對乳癌細胞的影響，我們採 取了三種不同的乳癌細胞株，各自有不同的特性（表一），
MDA-MB-231 為 ERα (－)、HER2/neu (－)的細胞株；MCF-7 為表現 ERα (＋)、HER2/neu (＋)的細胞株；BT-474 為表現 ERα (＋)、HER2/neu (＋＋＋)的細胞株。
細胞週期的探討方面，主要想知道經花生四烯酸處理過的細胞在
是否細胞週期的分布情形爲何。細胞以一個最有效刺激生長的濃度處 理後，每隔一段時間便收集細胞，用流式細胞儀分析細胞週期的分佈。
第三個探討的主題為找出花生四烯酸影響癌細胞生長的機制，在 此階段將以西方點墨法進行蛋白質表現的分析，試著找出是否有哪些 蛋白質的表現增加或減少而影響到了細胞株的生長，主要會從下列幾 方面進行探討：
1. AA 對於 PPARα蛋白質的表現量：由於 AA 為活化 PPARα的天然 配體，故探討 AA 是否可以活化 PPARα表現。
2. AA 對於細胞週期蛋白質的表現量：主要探討負責調控細胞週期 的蛋白質表現。將針對 Cylin、CDK、CDKI 進行探討。
3. AA 對於 MAPK 的影響：主要探討 ERK 2、p38 表現。由於此兩 種蛋白的活化會使得細胞產生增生的訊號，所以對這兩種蛋白質 的表現進行探討。
4. AA 對於細胞凋亡的影響：主要探討 Bax、Bcl-2 的表現。Bax / Bcl-2 的比例會影響到細胞凋亡，高比例Bax / Bcl-2 會使得細胞產生凋 亡，故探討 Bax / Bcl-2 的比例是否會有所影響。
本研究在實驗培養基中僅添加 1% FBS，其用意在於細胞能在足 夠量的必需脂肪酸含量下，來探討添加入AA 後所帶來的影響，才能 知道所添加的AA 會造成什麼影響。
第四章 研究材料及研究方法 第一節 研究材料
4-1-1 細胞株 :
此實驗選用三種不同的人類乳癌細胞株，分別為 MDA-MB-231 cells，MCF-7 cells，BT-474 cells，如表一。
4-1-2 藥品：
Merck公司：KCl、NaCl、NaF、 KH2PO 、Na HPO4 2 4
Sigma 公司：Arachidonic acid 、Bovine serum albumin（fatty
acid-free ）、 Insulin 、 β-Estrodiol 、 Wy14,643 、 N,N’,N’-tetramethyl-ethylene-diamine, TEMED 、
DMSO、Propidium iodide、EDTA、Triton X-100、
NP-40 、 SDS 、 Sodium deoxycholate 、 PMSF 、 Leupeptin、Aprotinin、2-Mercaptoethanol、Ammonium persulfate、glycerol、Sodium bicarbonate、PEG、
Sodium orthovanadate、Hydroxyurea
Bio-Rad 公司：40% acrylamide/bis-acrylamide solution (37.5:1) Amresco 公司：10X TG-SDS buffer、10X TG buffer
GIBCO 公司： Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM)、
Penicillin/Streptomycin、L-glutamine、0.25% Trypsin
PAA 公司：Fetal bovine serum
Fermentas Life Science 公司：PageRuler Prestained Protein Ladder Pierce 公司：SuperSignal® West Pico Chemiluminescence Substrate。
USB 公司：Tris、Trisodium dicitrate
PerkinElmer 公司：PVDF Transfer Membrane
Cell Signaling 公司：Prestained Protein Marker,Broad Range Fluka 公司：Methanol
Panreac 公司：Tween-20
Worthington Biochemical corporation：Ribonuclease A 4-1-3 抗體
Santa Cruz Biotechnology 公司：
anti-β-actin antibody 、 anti-CDK 2 antibody 、 anti-Cyclin E antibody、anti-ERK 2 antibody、anti-Bax antibody、anti-Bcl-2 antibody、anti-α-tubulin antibody、anti-mouse IgG-HRP、anti-rabbit IgG-HRP、anti-goat IgG-HRP antibody
Cayman Chemical 公司：
anti-PPARα antibody
BD Transduction Laboratories 公司：
anti-Cdk 4 antibody、anti-Ras antibody、anti-p38 antibody
Upstate 公司：anti-Cyclin D1/2 antibody 4-1-4 儀器
流式細胞儀 (FACS CaliburTM, Becton Dickinson, NJ, USA )、垂 直式無菌操作台、倒立式光學螢光顯微鏡、細胞培養箱、液態氮筒、
ELISA reader ( Enzyme-Linked Immunosorbent Assay reader)、Hoefer 電源供應器、BioRad 蛋白質電泳槽、BioRad 濕式蛋白質轉漬槽、水 浴槽、震盪器、-80℃與-20℃冷凍冰箱、4℃冷藏冰箱、Fuji 洗片機、
Kubota 離心機、Particle counter Z1。
第二節 實驗方法 4-2-1 脂肪酸之配製
1 mM Arachidonic acid-BSA 配製方法為取 2 mM arachidonic acid 與 1 mM BSA solution 以 1：1 比例混合，再以 0.2μm filter 過濾，
分裝後置 4℃中保存。
4-2-2 細胞株培養
MDA-MB-231 細胞株培養於 5% FBS、2 mM glutamine，100 μg/ml streptomycin 和 100 U/ml penicillin 的 Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) 中；MCF-7 細胞株培養於 5% FBS、2 mM glutamine，100 μg/ml streptomycin 和 100 U/ml penicillin、0.01
mg/ml insulin 的 Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM)中；
BT-474 細 胞 株 培 養 於 5% FBS 、 4 mM glutamine ， 100 μg/ml streptomycin 和 100 U/ml penicillin、0.01 mg/ml insulin 的 Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM)中。以上三種細胞以 5% FBS
作繼代培養，實驗中的細胞則改培養於1% FBS IMDM 中，MCF-7 與BT-474 細胞於實驗過程中添加 10 nM β-Estrodiol。細胞株放置於 37 ℃，5% CO2，溼度 95 %的培養箱中培養。
4-2-3 細胞存活率之分析
培養中的細胞經過胰蛋白酶的作用一分半鐘後，加入等量含 2.5% FBS的IMDM以中止胰蛋白酶的作用，取出細胞至 15mL離心 管，以 1000rpm離心 5 分鐘，移除上清液後拍散細胞，再加入適量 的培養基。之後將細胞平均分盤至 24 孔盤中，不同細胞所seeding 的個數各有不同， MDA-MB-231 細胞株為 2×104個/mL/well，MCF-7 細胞株為 5×104個/mL/well，BT-474 細胞株為 5×104個/mL/well。經 24 小時後，以不同濃度的花生四烯酸（5, 10, 20, 40 μM）處理細胞，
分別於 24, 48, 72, 96 小時計數細胞數目。細胞數目計數是使用細胞 計數器。細胞計數時，先移去培養基，以PBS洗一次後，加入 200 μL 胰蛋白酶作用一分半鐘，再加入200 μL含血清的培養基終止反應，
利用pipet將細胞打散後，將細胞混合於 9.6 mL的 0.9% NaCl中，搖
勻後直接利用細胞計數器計數細胞數目。所得的數值乘以 10 倍即為 細胞數目。
4-2-4 細胞週期分析
將細胞分盤於 12 孔盤中，不同細胞所seeding的個數各有不同，
MDA-MB-231 細胞株為 2×104個/mL，MCF-7 細胞株為 5×104個/mL，
BT-474 細胞株為 5×104個/mL，每一孔的培養基皆為 2mL。經 24 小 時後，以AA處理細胞，每隔 4 小時收一次細胞。細胞必須先經過酒 精固定隔夜後，才能使用流逝細胞儀進行細胞週期分析。細胞固定 過程為將培養基移除，以PBS洗一次後，加入 200 μL胰蛋白酶作用 一分半鐘，再加入200 μL含血清的培養基終止反應，細胞懸浮液移 至 15 mL離心管，以 1200 rpm離心 4 分鐘後，倒掉上清液，細胞拍 散後加入PBS，再以 1200 rpm離心 4 分鐘，之後倒掉上清液，細胞 拍散後，加入 1 mL含有 2% FCS的PBS，使細胞均勻分布後，再加 入 80%酒精固定細胞，移至-20℃冰箱凍存，隔夜後以流逝細胞儀進 行細胞週期分析。
酒精固定的細胞先解凍後，以1200 rpm 離心 4 分鐘，倒掉上清 液，細胞拍散後加入 PBS，再以 1200 rpm 離心 4 分鐘，之後倒掉上 清液，細胞拍散後，加入 0.5 mL solution A（3.4 mM sodium citrate，
PEG 6000，0.1% Triton X-100，44 units / mL RNAase，0.05 mg/mL
propidium iodide），置於 37℃半小時後，再加入 0.5 mL solution B
（0.56 mM NaCl，PEG 6000，0.1% Triton X-100，0.05 mg/mL propidium iodide），避光置於 4℃一個小時後，用流逝細胞儀進行細 胞週期分析。以 Cell Quest 軟體進行 10000 顆細胞的收集，再以 ModFit 軟體進行細胞週期的分析。
4-2-5 全細胞抽取液 ( Total cell extract ) 之製備
細胞經 AA 處理不同時間後，將細胞刮取下來，以 2000 rpm 離 心五分鐘後，去除上清液後加入適量 RIPA buffer ( pH 7.4 50 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、1 mM EGTA、0.05% 2-mercaptoethanol、150 mM NaCl、1% NP-40、0.25% sodium deoxycholate、0.2 mM PMSF、
5 μg/μL Leupeptin、5 μg/μL Aprotinin、0.1 mM NaF、2 μg/μL sodium vanadate)於冰上作用 30 分鐘，以 14000 rpm 離心 30 分鐘，收集上 清液並測量蛋白質濃度。
4-2-6 蛋白質含量測定
蛋白質溶液經適當稀釋後，先將 200 μL Bio-Rad protein assay 試 劑（稀釋五倍）加入 96 well ELISA microplate，再取 10 μL 待定量 的稀釋樣品及系列稀釋之標準溶液 BSA 中，均勻搖勻後，於室溫下 反應 5 分鐘後，以 ELISA reader 測 620 nm 吸光值。根據標準曲線 計樣品之蛋白質濃度。
4-2-7 西方墨點法
將蛋白質濃度稀釋為1mg/mL，置於沸水煮 5 分鐘，待冷卻後將 等量蛋白質樣品分別加入各個樣品凹形槽中，利用 12% SDS- polyacylamide gels 及 30 mA 電流分離蛋白質。
轉印（Transfer）時，PVDF 轉印膜先以甲醇活化 5 秒鐘後，以二 次水浸潤二分鐘，再以transfer buffer（25 mM Tris-HCl，pH 8.4，含 192 mM glycine 及 15% methanol）浸潤五分鐘後備用。蛋白質分離 後，將 stacking gel 去除，留下 separating gel，依序將海綿、濾紙、
separating gel、PVDF 膜、濾紙、海綿放於三明治夾板中，接著放入 轉印槽中，灌滿transfer buffer，以 70 伏特電壓進行轉印二小時，轉 印期間都是於冰浴下進行。轉印完成後，取出 PVDF 膜，以 PBST
（PBS + 0.1% Tween-20）清洗二次，每次十分鐘，之後放入 5%脫 脂牛奶中進行 blocking，放於 4℃，隔夜後進行免疫染色。
將 PVDF 轉印膜由 5%脫脂牛奶中取出，以 PBST 沖洗 3 次，
每次5 分；接著將 PVDF 轉印膜置於一級抗體中，於室溫下作用兩 小時取出。各種一級抗體稀釋倍率如下：PPARα（1:500）、Cyclin D1
（1:1000）、Cyclin E（1:500）、Actin（1:1000）、α-Tubulin（1:1000）、
CDK 2（1: 500）、CDK 4（1: 500）、ERK 2（1：1000）、p38（1：1000）、
Bax（1：1000）、Bcl-2（1：1000）。PVDF 以 PBST 清洗 4 次，每次
10 分鐘；接著置於接有 HRP 之 anti-rabbit IgG、anti-mouse IgG、
anti-goat IgG 的二級抗體（1:5000）中，於室溫下作用一小時取出。
PVDF 以 0.3% PBST 清洗 2 次，每次 10 分鐘，再以 0.1% PBST 清 洗2 次，每次 10 分鐘。最後以 ECL 試劑組呈色，Kodak X 光底片 曝光呈像，並利用Kodak EDAS 290 軟體進行分析。
4-2-8 細胞同步化
將細胞分盤於 12 孔盤中，不同細胞所seeding的個數各有不同，
MDA-MB-231 細胞株為 2×104個/mL，MCF-7 細胞株為 5×104個/mL，
BT-474 細胞株為 5×104個/mL，每一孔的培養基皆為 2mL。經 24 小時 後，更換成含有 2mM hydroxyurea的培養基培養 15 小時，之後去除 含2mM hydroxyurea的培養基，以PBS清洗細胞兩次再以新鮮培養基 清洗一次後，加入含1% FBS的培養基，再以AA處理細胞，於 0、2、
3、6 小時收一次細胞。細胞必須經過酒精固定隔夜，逝細胞儀進行 細胞週期分析。細胞固定過程為將培養基移除，以PBS洗一次後，加 入200 μL胰蛋白酶作用一分半鐘，再加入 200 μL含血清的培養基終 止反應，細胞懸浮液移至15 mL離心管，以 1200 rpm離心 4 分鐘後，
倒掉上清液，細胞拍散後加入PBS，再以 1200 rpm離心 4 分鐘，之後 倒掉上清液，細胞拍散後，加入1 mL含有 2% FCS的PBS，使細胞均 勻分布後，再加入 80%酒精固定細胞，移至-20℃冰箱凍存，隔夜後
以流逝細胞儀進行細胞週期分析。
4-2-9 統計方法
本實驗所得之實驗數據，採用SPSS 電腦統計套裝軟體中之變
異數分析 (one-way-ANOVA)及 Post Hoc 檢定中的 Turkey 進行多重比 較，各處理組間差異之顯著性，當 p 值小於 0.05 以下時，則認為具 統計上意義。