研究樣本來源

本研究所採用的樣本主要來源於接受產前診斷的孕婦，剔除有家族遺傳史及 有病理意義診斷的樣本後(如超音波影像顯示結構或發育上的畸形)，共收集了 1015 個樣本，其中內含羊水、臍血、絨毛膜等樣本各971、35、9 個。這些樣本採用 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN)來萃取 DNA，並以標準的操作 步驟執行。

第二節 以 CMDX Bac Clone aCGH 分析基因組中的基因組劑量變 異

所萃取的1015 個 DNA 樣本以微陣列基因晶片(CMDX: CA2500/ CA3000)執 行基因組劑量變化的分析。CMDX Bac array CA2500/ CA3000 Platform 分別含有 2437 個與 3039 個不同的 Large-Insert Clone，分佈於整個基因組，每個 Clone 的大 小約150~250kb 不等。CMDX Bac Array Platform 採用 Dye swap，使待測檢體與參 考檢體分別在Forward 與 Reverse Array 區進行競爭型雜交反應，由於每一個 Bac Clone 在 Forward Array 區與 Reverse Array 區分別有 3 個重複的探針，因此整張晶 片上每一個Bac Clone 總計有 6 個重複的探針，由 6 個探針所測得螢光訊號的平均 值來評估該相對應位置的遺傳物質劑量。當待測基因組有劑量不平衡的現象存在 時，Forward Array 區與 Reverse Array 區探針的螢光值應呈相對的增加或減少(即當 一區為Duplication 的反應，另一區必為 Deletion 的反應)，而當兩區的平均螢光值 呈現相對應的結果，取 Log2 後的數值若超過評估的閾值(±0.3)，分析軟體才會判 讀為有劑量變異發生；若兩區螢光值呈現一致性的結果，或平均螢光值取Log2 後 未達閾值，則不予判定。這樣的設計提供了操作上品質管制的機制，能降低偽陽

性率及雜訊的干擾，提供良好專一性及再現性的判讀結果。

以標準的操作方法進行比較式基因組雜交分析，首先配置適量(2μι)的待測 樣本及參考樣本，於超音波震盪器上將DNA 打碎成適當的片段，然後將 DNA 樣 本分裝成兩組，分別標示不同的螢光，即待測樣本+Cy3、參考樣本+Cy5；另一組 則將螢光交換染色(待測樣本+Cy5、參考樣本+Cy3)。接著將已加入螢光的 DNA 樣 本置於 99℃的乾浴槽加熱 5 分鐘，再放置冰上 5 分鐘，然後加入 3μι 之 Exo-Klenow，此目的為造成 DNA 變性(Denature)，促使螢光染劑嵌入 DNA 雙股結 構，然後將DNA 樣本置於 37℃水浴槽，至少作用兩個小時。

兩個小時後，將染有Cy3 的待測樣本與染有 Cy5 的參考樣本混合，另一組染 有Cy5 的待測樣本與染有 Cy3 的參考樣本亦混合在一起，接下來便利用特殊的 Spin Column Tube ( Invitrogen)，與 Binding Buffer、Wash Buffer、5M NaCl、75％

Isopropanol、70％Ethanol 來純化並沉澱 DNA，過程中亦加入 Cot-1 DNA 來降低非 特異性重複序列所引起的交叉干擾。

純 化 後 的 DNA 樣 本 先 置 入 乾 燥 箱 中 做 完 全 乾 燥 ， 然 後 再 加 入 25μl Hybridization Buffer 將 DNA 樣本打散、混合均勻，接著將兩組 DNA 樣本放置於 基因晶片上Forward 矩陣區與 Reverse 矩陣區、蓋上蓋玻片，進行競爭型雜交反應，

此雜交反應須於42℃恆溫培養箱中至少作用 16 個小時，並保持適當的溼度。雜交 步驟後，以Wash Solution 2X SSC-0.5％SDS、2X SSC-50％ Formamide、2X SSC-0.1

％ Igepal、2X SSC 等，分別於 50℃恆溫振盪培養箱中緩慢搖晃以去除蓋玻片、清 洗晶片，並使其乾燥。最後以掃描儀與CMDX Software 偵測晶片上每一個探針的 相對螢光強度，判讀是否有Segmental DNA Gain 或 Loss 的訊號。如遇有病理意義 的結構變異，則將該樣本由研究族群中予以排除。

Fragmentation

Random Priming

Incubation in 37℃, 2 小時

圖二：Bac Array CGH 的操作流程

純化、沉澱、乾燥

以Hybridization Solution 均質化

雜交，42℃，16 小時

清洗，乾燥

掃描，分析

第三節 以 Competitive Multi-Plex PCR 驗証 CMDX Bac Array 的基 因組劑量變異訊號

Competitive Multi-Plex PCR 是評估特定位置的基因其劑量增加或減少的有 效方法，其原理為使目標基因與參考基因在同一個PCR 反應中進行競爭型的基因 產物擴增，然後執行電泳，依待測檢體其目標基因產物與參考基因產物的訊號比 值、參考檢體其目標基因產物與參考基因產物的訊號比值，進行相除比較，以評 估基因劑量的增加或減少。分析方法如下所示。(30)

Peak area of candidate gene (U)/ Peak area of reference gene (U) Peak area of candidate gene (C)/ Peak area of reference gene (C)

(U): Unknown，表示未知的待測檢體 (C): Control，表示參考檢體

挑選 4 個 Bac Clones 作為驗證基因組劑量變異訊號的對象，其中兩個 Bac Clones：RP11-556H10、RP11-85G7，僅在一個進行人工流產所取得的臍帶檢體觀 察到基因組劑量變異的訊號，其位於12p12.3 的位置；另外兩個 Bac Clones 則在台 灣族群中普遍存在 CNV，分別是位在 4p16.1 的 RP11-301J10 與位在 6p25.3 的 CTD-2249D1。針對上述 4 個 Bac Clones，分別挑選其所內含的基因：RERG、

PIK3C2G、CPZ、DUSP22 等設計引子，並隨機挑選樣本，以 Competitive Multi-Plex PCR 驗證樣本在上述 4 個 Bac Clones 的劑量變異訊號。

將源自於上述4 個 Bac Clone 的基因：RERG、PIK3C2G、CPZ、DUSP22，

與參考基因 FGFR2、Kirt 分別在同一 PCR 反應中進行競爭型的 PCR 反應，PCR 反應的最終容積為25μL，其包含的內容物與相對應的反應模組敘述如下：

(1) RERG+ FGFR2 +Kirt

PCR 反應溶液裡含 100ng DNA、200μM dNTP、2mM MgCl2、2.5μL 10X

Copy Number = X 2

buffer II、0.5U AmpliTaq Gold enzyme、0.025μM FGFR2 引子、0.03μM Kirt 引子、0.08μM RERG 引子，先於 95℃下使 DNA 變性 10 分鐘，接著連續 在94℃/30 秒、57℃/45 秒、72℃/45 秒擴增基因產物 25 循環，最後於 72℃延伸 10 分鐘。

(2) PIK3C2G+ FGFR2 +Kirt

PCR 反應溶液裡含 100ng DNA、200μM dNTP、2mM MgCl2、2.5μL 10X buffer II、0.5U AmpliTaq Gold enzyme、0.025μM FGFR2 引子、0.03μM Kirt 引子、0.05μM PIK3C2G 引子，先於 95℃下使 DNA 變性 10 分鐘，接著 連續在94℃/30 秒、57℃/45 秒、72℃/45 秒擴增基因產物 25 循環，最 後於72℃延伸 10 分鐘。

(3) CPZ+ FGFR2 +Kirt

PCR 反應溶液裡含 100ng DNA、200μM dNTP、2mM MgCl2、2.5μL 10X buffer II、0.5U AmpliTaq Gold enzyme、0.025μM FGFR2 引子、0.03μM Kirt 引子、0.05μM CPZ 引子，先於 95℃下使 DNA 變性 10 分鐘，接著連續 在94℃/30 秒、54℃/45 秒、72℃/45 秒擴增基因產物 25 循環，最後於 72℃延伸 10 分鐘。

(4)DUSP22+ FGFR2 +Kirt

PCR 反應溶液裡含 100ng DNA、200μM dNTP、2mM MgCl2、2.5μL 10X buffer II、0.5U AmpliTaq Gold enzyme、0.035μM FGFR2 引子、0.04μM Kirt 引子、0.05μM DUSP22 引子，先於 95℃下使 DNA 變性 10 分鐘，接著連 續在94℃/30 秒、57℃/45 秒、72℃/45 秒擴增基因產物 25 循環，最後 於72℃延伸 10 分鐘。

接著使用GCK-500 cartridge kit (eGene, Irvine, CA, USA)來分離不同大小片段 的DNA 產物，首先取用 5μL 的 PCR 產物加入 15μL 的 dH2O 中，稀釋 4 倍，

後Biocaculator Software 便可自動標示出 DNA 產物的大小、分離先後順序及相對 劑量。

將Competitive Multi-Plex PCR 的結果與原 CMDX Bac Array 的基因組劑量變 異訊號進行比對，分別評估CMDX Bac Array 的偽陽性率及偽陰性率。偽陽性率=

基因晶片顯示有劑量變化但 Multi-Plex PCR 未顯示出劑量變化的件數/ 基因晶片 顯示有劑量變化的總件數；偽陰性率=基因晶片未顯示劑量變化但 Multi-Plex PCR 顯示有劑量變化的件數/ 基因晶片未顯示劑量變化的總件數。分析的結果可用以評 估此CMDX CA2500/ CA3000 Bac Array 平台的準確度。

第四節 與現有基因組變異資料庫進行比對

人類基因組變異資料庫http://projects.tcag.ca/variation 持續收錄自 2004 年以來 研究基因組結構變異的文獻的研究結果，提供了人類基因組全面的結構變異摘 要，透過這個平台，將1015 個樣本所觀察到的基因組劑量變異與先前文獻的分析 結果做一比對，統計台灣族群廣泛存在或具獨特性的基因組劑量變異。

圖三：人類基因組變異資料庫http://projects.tcag.ca/variation 搜尋介面

圖四：Bac Clone: CTD-2041D13 (Chr5:69364823-69448911)於資料庫的搜尋結果

第三章 結果

以 CMDX Bac Array CA2500/ CA3000 觀察 1015 個產前檢查樣本其基因組劑 量變異在基因組的分佈，總計發現 4152 個劑量變異(gain or loss)的訊號，分佈在 438 個 Bac Clone 與 252 個 Cytobands 中。平均每個人可觀察到 4.36 個基因組劑量 變異，但如果將 CA2500 與 CA3000 平台分開統計，CA2500 可觀察到的平均基因 組劑量變異次數為 4.84 次，CA3000 則略低，為 3.88 次。

全基因體結果圖示(Whole genome View)

表一：分析檢體來源一覽表

表二：個體的平均基因組劑量變異

圖五：樣本 509 的全基因組基因組劑量變異掃描結果圖

以 Multi-Plex PCR 方法驗證 CMDX Bac Array 的可信度，挑選於 6p25.3、

4p16.1、12p12.3 等位置有劑量變化的樣本共 57 個，而由 Multi-Plex PCR 取得一致 性的結果共 56 個，評估偽陽性率為 1.75%。其中，分析結過呈現不一致的樣本為 Sample313-2，經重覆分析後 Sample313-2 的 Multi-Plex PCR 結果仍為 Wild Type (Bac Array 結果為 Deletion Type)，此偽陽性的結果極可能為 Multi-Plex PCR 於 6p25.3 所設計的探針位置，並未和 sample313-2 產生劑量變異的位置重疊，因此使 得 CMDX Bac Array 的分析結果與 Multi-Plex PCR 不一致。另於上述位置挑選沒有 劑量變化的樣本 30 個，以 Multi-Plex PCR 取得一致性的結果為 30 個，評估偽陰 性率為零。由上述精確度的分析，評估此 Bac Array 的平台適合用於鑑別基因組劑 量變異的存在。

圖六：樣本 313-2 在 Chr 6 的 aCGH 結

圖七：參考檢體在 6p25.3/ DUSP22 gene 的劑量

圖八：樣本 313-2 在 6p25.3/ DUSP22 第一次 Multi-Plex PCR 結果

圖九：樣本 313-2 在 6p25.3/ DUSP22 第二次 FGFR2

FGFR2 FGFR2

Kirt Kirt Kirt

DUSP22 DUSP22 DUSP22

圖十一：參考檢體在 6p25.3/

DUSP22 gene 的劑量表現

FGFR2

DUSP22

圖十二：樣本 H268 在 6p25.3/

DUSP22 gene 的 Deletion 表現

圖十四：參考檢體在 4p16.1/ CPZ gene 的劑量表現

圖十五：樣本 H490 在 4p16.1/ CPZ gene 的 Duplication 表現

FGFR2

Kirt

CPZ CPZ FGFR2

DUSP22 Kirt

圖十：樣本 H268 在 Chr 6 的 aCGH 結 果，6p25.3 有一 clone 為 Deletion 表現

Kirt

Kirt

FGFR2 Kirt

圖十三：樣本 H490 在的 Chr 4 的 aCGH 結 果，4p16.1 有一 clone 為 Duplication 表現

註：樣本 H268、H490 與 321 的 Multi-Plex PCR 分析結果與 Bac Array 結果一致 圖十七：參考檢體在 12p12.3/

RERG gene 的劑量表現

圖十八：樣本 321 在 12p12.3/

RERG gene 的 Duplication 表現 FGFR2

RERG RERG

圖十九：參考檢體在 12p12.3/

PIK3C2G gene 的劑量表現 PIK3C2G

圖二十：樣本 321 在 12p12.3/ PIK3C2G gene 的 Duplication 表現

FGFR2 Kirt

PIK3C2G Kirt

Kirt FGFR2

圖十六：樣本 321 在的 Chr 12 的 aCGH 結果，有 2 個 clone 為 Duplication 表現

Kirt FGFR2

圖二十一：台灣族群基因組劑量變異分佈

根據 CMDX Bac Array 的觀察結果，台灣族群常見的 CNV 大多都發生於 Centromere 與 Telomere 的位置，與先前文獻的觀察一致。而在台灣族群中，第 3、

13、18、20、21 是比較少出現 CNV 的，最常出現 CNV 的位置是 14q11.2(32.41%)、

14q32.33(42.66%) 、 15q11.2(44.14%) 、 19p13.2(31.03%) 、 22q11.22(31.33%) 、 Yq12(23.05%)等位置，這些位置在台灣族群中出現 CNV 的頻率皆超過 20%。

圖二十二：台灣族群常見發生基因組劑量變異的位置 （Incidence>1%）

分析於台灣族群所看到的基因組劑量變異，其中有 39.60%的區域屬於缺失 的形式；36.47%的區域屬於複製的形式；而有 23.93%的區域是兩種形式兼有之。

這 些 基 因 組 劑 量 變 異 分 佈 的 區 域 有 54.79% 與 基 因 組 中 已 知 的 Segmental Duplication 分佈的位置重複，Segmental Duplication 和基因組劑量變異的高相關 性與先前文獻的觀察是一致的，顯示 Segmental Duplication 的存在及 Non-Allel Homologous Recombination 的發生是造成大片段基因組劑量變異的主要機制。這 些基因組劑量變異的訊號，絕大多數(92.44%)的涵蓋範圍不超過 1~3 Bac Clones 的長度，大小不及 1Mb；只有少數(7.56%)的涵蓋範圍大於 1Mb，其主要分佈在

這 些 基 因 組 劑 量 變 異 分 佈 的 區 域 有 54.79% 與 基 因 組 中 已 知 的 Segmental Duplication 分佈的位置重複，Segmental Duplication 和基因組劑量變異的高相關 性與先前文獻的觀察是一致的，顯示 Segmental Duplication 的存在及 Non-Allel Homologous Recombination 的發生是造成大片段基因組劑量變異的主要機制。這 些基因組劑量變異的訊號，絕大多數(92.44%)的涵蓋範圍不超過 1~3 Bac Clones 的長度，大小不及 1Mb；只有少數(7.56%)的涵蓋範圍大於 1Mb，其主要分佈在