研究目的

1. 建立 modified Edman degradation 方法以分析體內蛋白質鍵結物 (HEV)。

2. 探討抽煙與體內 HEV 值之相關性。

3. 估算個人因抽煙暴露到環氧乙烷之內在劑量及外在濃度。

4. 評估因抽煙暴露到環氧乙烷對人體之致癌風險。

貳 文獻探討

一、環氧乙烷

(一) 環氧乙烷之物化性質

環氧乙烷在常溫下是無色氣體，分子量為 44.05，比重為 0.882 (10

℃)，沸點 10.7℃，熔點-111℃，蒸氣密度為 1.52， 20℃時其蒸氣壓 為 1,095 mmHg，為一種易燃性氣體，在空氣中爆炸範圍為 3-100％。

氣味似醚類，可溶於水。應避免與鹼金屬氫氧化物或高活性觸媒(如 無水氯化鐵、氯化錫等)一起反應，與銅和酸類皆不相容，而其八小 時日時量平均容許濃度（ TLV-TWA）為 1 ppm，短時間時量平均容許 濃度（TLV-STEL）為 2 ppm⁽¹¹⁾。

(二) 環氧乙烷之用途

60%之 EO 用於製造乙二醇，12%是製造非離子的活性劑，而較 少部分是製造乙二醇醚、乙醇胺和其他化學物質⁽⁷⁾，如紡織、洗潔劑、

防凍劑、膠黏劑等製品之化學中間產物，其他用途尚包括：

1. 醫院中之儀器、塑膠器材之消毒。

2. 水果之促進成熟劑、防黴劑。

3. Kreb’s 腹水腫瘤細胞之惰化劑。

4. 煙草葉之成熟促進劑。

5. 火箭推進劑。

6. 製造 Acrylonitrile 所用的原始物質。

(三) 環氧乙烷暴露來源

1. 當工廠未有完全控制設施或工廠現場操作異常時，則 EO 會釋放到 空氣中。

2. 呼吸到污染的空氣或汽機車排放之廢氣：含有大量乙烯，其在體內 會氧化成 EO。

3. 經由抽煙所吸入：香煙中含有 250μg 之乙烯及 5μg 之 EO⁽²⁾。

(四) 環氧乙烷之健康危害

1. 動物研究

Saillenfait 等人⁽¹²⁾以 Sprague-Dawley 懷孕的大鼠進行研究，以吸 入方式暴露 EO，發現於暴露到 800 和 1200 ppm 時，會使胎兒重量減 輕，且隨劑量增加，大鼠減輕的重量亦會增加。Weller(1999)⁽¹³⁾以懷 孕的母鼠進行研究，經吸入方式暴露 EO，結果發現胎兒死亡、畸胎 機率會增加。而 Setzer⁽¹⁴⁾以猴子為研究樣本，使其暴露到 100ppm EO，發現體重比起一般猴子明顯減少，至於神經傳導速度與一般族 群比較，並沒有明顯差異。有文獻⁽¹⁵⁾指出，懷孕的老鼠暴露到 100 ppm EO，其懷孕時間會比一般懷孕的老鼠還長，而胎兒出生時體重亦會 減輕。

另有研究⁽¹⁶⁾發現，EO 暴露會使鼠及猴子之姊妹染色體交換、染 色體異常的機率增加，亦會造成肺腫瘤、腺瘤及子宮腫瘤，而睪丸重 量及精蟲濃度也會減輕。Generoso⁽¹⁷⁾以吸入方式使公鼠連續 4 天暴露 到 EO，每天暴露到 1800, 2400 或 3000 ppm-hr 之劑量，結果發現 EO 濃度增加會使 dominant-lethal mutations 增加，但不是呈線性關係。若 以飲水方式使老鼠慢性暴露到 EO 連續 30 天，發現在暴露到 10 mM EO 後，其突變頻率比一般老鼠增加 2.4 倍⁽¹⁸⁾。Lynch⁽¹⁹⁾等人以 Fischer

344 大鼠進行研究，使暴露到 0, 50, 100 ppm 之 EO，發現所有暴露族 群之體重皆明顯減輕、死亡率增加，且 mononuclear cell leukemia、

peritoneal mesothlioma 及 mixed cell brain giloma 之發生率亦明顯增 加。Snellings⁽²⁰⁾以吸入方式使 Fischer 344 大鼠暴露到 0, 10, 30, 100 ppm 之 EO，經四個月後，發覺 mononulear cell leukemia 之發生率增 加，且暴露 EO 濃度為 33, 100 ppm 之族群，其母鼠之癌症發生率亦 增加。而使 Lewis rats 以飲水方式暴露 EO 的研究，發覺會使其體內 HPRT mutant frequency 增加，且比非暴露組高出 2.5 倍 ⁽²¹⁾。

2. 人體危害

(1) 急性毒性

刺激喉嚨、肺部產生咳嗽、噁心、嘔吐、頭痛、呼吸困難、衰 弱、神經失調、腹內壓迫感、頻尿等症狀。高濃度暴露則會造成抽 慉、昏迷甚至死亡；且會引起皮膚水泡、浮腫、灼傷、凍傷或嚴重 皮膚炎，並可能會刺激眼睛造成灼傷⁽¹¹⁾。

(2) 慢性毒性

EO 會傷害神經系統，導致失去嗅覺、焦慮不安、手腳無力；

損傷肝和腎，或產生皮膚過敏等症狀⁽¹¹⁾。Tates⁽¹⁸⁾針對 6 位醫院消毒 員工及 8 位非暴露者進行研究，結果發現暴露者與非暴露者之 HPRT 突變頻率有明顯差異(p=0.003)，而同時針對 15 位 EO 暴露員 工及 15 位非暴露者之研究發現，暴露者之 CA 頻率比非暴露者高 2 倍(p<0.0001)，HPRT 突變頻率亦有明顯差異。Dellarco⁽¹⁶⁾的研究發 現 EO 暴露與 SCEs 值間有 dose-response 相關，而 Schulte⁽²²⁾亦有類

患胃癌、腦癌、胰臟癌^(24-27)、白血病⁽³⁾及乳癌⁽²⁸⁾的危險性比起非暴 露者皆會明顯增加，而 Hodgkin’s disease 發生率亦會增加⁽¹¹⁾；並有 證據表示長期暴露到高濃度 EO（700ppm）的人，其白內障發生率 也會增加⁽¹¹⁾。

(3) 生殖影響

EO 也使用於牙科診所儀器的消毒，Rowland⁽¹⁵⁾針對在牙科工作 懷孕之助理進行研究，發覺其自然流產及早產的危險性比非暴露之 懷孕者增加 2.7 倍。Hemminki⁽⁸⁾的研究則表示從事醫院消毒工作的 女性，其自然流產的危險性比其他部門的女性高三倍。

二、蛋白質鍵結物

(一) 定義

蛋白質是由 20 種不同胺基酸所組成，每一胺基酸中的 O、N 或 S 常含有多餘的電子對，可與親電子物質 (electrophiles) 反應⁽²⁹⁾形成共 價鍵結物。環境中的有害化學物質在進入體內後會被代謝成活化的親 電子之中間產物，容易與蛋白質的胺基酸中具親核性的原子反應，而 形成共價鍵結物，此產物稱為蛋白質鍵結物 (protein adducts)⁽⁹⁾。

(二) 形成與意義

基因毒物 (genotoxicants)或其代謝物與 DNA 鹼基形成的共價鍵結 物 (DNA adducts)，因與化學致癌機制有直接關係，而被公認為是與致 癌風險相關的生物指標。但在實際應用上 DNA adducts 樣本量少且取 得不易，加上 DNA adducts 半衰期往往比較短，而且會被基因修補酵 素修復，因此在人體內比較不易累積。反觀 protein adducts 不僅不會影 響蛋白質原有的功能，而且樣本量多不會被酵素修復⁽³⁰⁾，它的半衰期 與原來的蛋白質一樣長，故其濃度會隨暴露時間與劑量而累積。如欲 執行長期暴露評估時，protein adducts 比 DNA adducts 更能代表累積暴 露劑量，再加上形成 DNA adducts 的物質，也會形成 protein adducts⁽³⁰⁾， 而且兩者之間有良好的線性關係，因此 Lars Ehrenberg 等人⁽³¹⁾於 1974 年提出以 protein adducts 代替 DNA adducts 作為暴露評估的生物指標。

就誘發 protein adducts 的物質而言，可分為兩類⁽³²⁾。較常見的為分 子量小之物質，這些致癌物或其親電子物質包括：ethylene oxide、

chloroacetaldehyde)。這些化學物質形成的蛋白質共價鍵結物不會影響 其原有的功能，且對於胺基酸反應的位置並沒有選擇性，adduct 的量 主要由不同胺基酸反應之反應速率而決定。第二種為分子量大及脂溶 性的物質，例如 Aflatoxin B1 (AFB1)和多環芳香羥化合物(PAH)。蛋白 質的空間結構會影響 protein adducts 的形成，這些化合物與蛋白質的反 應 產 物 無 法 預 測 。 此 類 反 應 的 最 好 例 子 是 N-sulfonyloxy-N-acetyl-4-aminobiphenyl 和 serum albumin 形 成 的 adducts。

實際上 protein adducts 種類很多，如何選擇適當的 protein adducts 進行研究，則可依下列條件⁽³²⁾：(1)在生物體內的化學性穩定；(2)對蛋 白質穩定性及功能的影響；(3)易進行人群樣本分析研究；(4)protein adducts 和 DNA adducts 間相關性佳；(5)由 protein adducts 的量可得知 其外在暴露劑量。到目前為止尚未發現有一 protein adduct 能完全滿足 以上的條件，只有血紅素(Hb)和 albumin adducts 能符合前四項標準

(32)。然而血紅素的生命週期 120 天比 serum albumin(半衰期 20-25 天)

3. Lysine

CH2 CH2 CH NH₃

+

CH2

H₂C

NH3 +

COO-4. Histidine

HN NH CH₂

+

CH COO -NH₃

+

其中 cysteine, histidine 和 N-terminal valine 很容易與親電子物質產 生共價鍵結物。

S Nτ-methylhistidine

S-(2-carboxyethyl)cysteine

圖一 常見之蛋白質鍵結物

(三) 分析方法：

1. Total protein hydrolysis：一般使用 6N 鹽酸在 120℃下反應，使蛋白 質完全斷裂成胺基酸，再用氣相層析儀-質譜儀 (GC/MS) 分析胺基 酸與外來物或其活性代謝物形成之共價鍵結物。

2. Mild hydrolysis⁽³⁵⁾：一般使用 1N 氫氧化鈉與蛋白質反應，將胺基酸 與活性物質形成的 carboxyl group 共價鍵打斷，使其釋放出 ester adducts ， 再 以 CH2Cl2 及 hexane 萃 取 ， 並 作 衍 生 反 應 後 ， 以 GC/MS-NCI 分析。

3. Raney nickel⁽³⁶⁾：主要是使用 Raney nickel 來切斷 Hb 或 albumin 中 之 cysteine residue 中的碳-硫鍵(carbon-sulfur bonds) ，釋放出含 sulfhydryl 官能機的活化物質。再經衍生反應後以 GC/ MS-NCI 分 析之。

4. Modified Edman degradation⁽⁹⁾ ： 以 NaOH 、 pentafluorophenyl isothiocyanate (PFPITC) 參與反應，再以二乙醚、蒸餾水及 Na2CO3

溶液萃取，以 GC/ MS-NCI(EI)分析 alkylated N-terminal valine 的衍 生物。

5. Immunochemistry — 酵素聯結免疫吸著分析法(ELISA) ：一酵素先和 抗體結合且與一受質(substrate)反應，產生一有色產物，並加以測量 其 adduct 值。

其中 total protein hydrolysis 方法較耗時，敏感度較低，有非常高濃 度的正常胺基酸，首先需要前處理將正常胺基酸與修飾的胺基酸分 離，因在濃度低時不易分析或分析結果不確定性較高，故近來較不常 用⁽³⁷⁾。

以 styrene 為例

Mild hydrolysis：

+R-COOH

SO-COOH adduct styrene glycol (SG) SG-PFB

Raney Nikle：

1-PE-PFB 1-phenylethanol (1-PE)

SO-cyateine adduct (α binding)

C6F5

SO-cysteine adduct(βbinding) 2-phenylethanol (2-PE) 2-PE-PFB

Edman degradation：

+R-NH₂

CH O H

CH₂ NH R

Edman Degradation

CH OH

CH₂ N N

O CH H₃C CH₃

C₆F₅

SO-valine adduct pentafluorophenyl thiohydantoin

以 GC/MS 分析 protein adducts，其優點⁽³⁸⁾包括：(1)可提供分析物 的化學結構；(2)對分析物之專一性高；(3)儀器敏感度高；(4)有可能偵 測多種生物標誌。

文獻上的例子很多，在 1978 年 Calleman 等人⁽³⁹⁾即以 total protein hydrolysis 方法分析 EO 暴露所產生的 N^τ-(2-hydroxyethyl)histidine (HOEtHis)；接下來 Farmer 等人分別於 1980⁽⁴⁰⁾、1981⁽⁴¹⁾及 1992⁽⁴²⁾年以 相同方法分析因 ethylating agents、methylating agents 及 propylene oxide 暴露而與 Hb 的 histidine 所產生的 S-ethylcysteine、S-methylcysteine 和 N^τ-(2-hydroxypropyl)histidine；Bailey⁽³⁷⁾於 1986 年亦以 total protein hydrolysis 方 法 分 析 acrylamide 暴 露 所 產 生 的 S-(2-carboxyethyl)cysteine，而於 1987 年⁽⁴³⁾亦以此方法分析 acrylamide 之暴露，其結果指出 acrylamide 暴露者的 HOEtHis 值為 0.55-8.0 nmol/g globin，非暴露者(背景值)為 1.41 nmol/g。

Törnqvist⁽²⁾以 modified Edman degradation 方法，測定因抽煙暴露 到環氧乙烷而產生的 N-(2-hydroxyethyl)valine (HEV)；Bailey(1987)⁽⁴³⁾ 以相同方法分析 HEV，偵測極限可達 0.1 nmole/g globin。1993 年，

Hecht⁽³⁵⁾以 mild hydrolysis 方法分析香煙中 N-nitrosonornicotine (NNN) 及 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) 在體內形成 的 4-hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone (HPB)。

(四) N-(2-hydroxyethyl)valine

環氧乙烷是親電子化物，不需代謝即可與蛋白質反應，其中與人 體血紅素中的 histidine 及 N-terminal valine 反應所產生的蛋白質鍵結 物為 N^τ-(2-hydroxyethyl)histidine (HOEtHis)、N-2-hydroxyethyl-valine (HEV)⁽⁴⁴⁾。而 Calleman(1978)⁽³⁹⁾首先針對 5 位德國暴露 EO 之消毒工 人及兩位非暴露人員，以測量 HOEtHis，結果發現消毒人員之 adduct 值 (0.5-13.5 nmol/g) 比對照人員 (0.05 nmol/g) 高出許多。

許多研究⁽⁴⁰⁾皆證實 HOEtHis 和 HEV 可用來作為偵測 EO 暴露之 指標。雖然 cysteine 和 histidine adducts 可當作偵測高暴露劑量之致癌 物之生物劑量，但其背景值高，會限制低劑量時暴露之敏感度⁽⁴¹⁾。而 HEV 的測量，因血紅素中背景值低，則可使偵測 EO 暴露更敏感。

有研究⁽²⁾指出每支香煙約含有 5μg 環氧乙烷，故抽煙亦會使血 紅素中 HEV 值增加。1986 年 Törnqvist⁽²⁾之研究指出，非抽煙者的 HEV 平均值為 58 pmol/g Hb，而抽煙者體內 HEV 濃度為 389 pmol/g Hb。而 Mowrer⁽⁴⁵⁾以 modified Edman degradation 方法分析血紅素中 HEV，偵測極限為 1 nmol HEV/g Hb，較 Törnqvist⁽⁹⁾與 Bono⁽⁴⁴⁾分析 HEV 的結果為高，其偵測極限可低至 0.01 nmol/g Hb。Bailey⁽⁴⁶⁾於 1988 年之研究結果為非抽煙者平均 HEV 值為 50 pmol/g globin，抽煙者則 為 200 pmol HEV/g globin，Bader⁽¹⁰⁾於 1995 年的研究也指出抽煙者的 HEV 值平均為 171±93 pmol HEV/g Hb，而非抽煙者的背景值平均為 46±12 pmol HEV/g Hb。Muller(1998)⁽⁴⁷⁾則表示，抽煙者體內 HEV 值

（中位數為 280 pmol/g Hb）比非抽煙者（中位數為 50 pmol/g Hb）高 5 倍以上。Törnqvist(1992)⁽⁴²⁾針對雙胞胎的研究中指出抽煙量與 HEV 生成量有明顯相關。Ehrenberg(1995)⁽⁴⁸⁾則表示一般人體內 HEV 的背 景值約 20 pmol/g Hb，在動物實驗也得到相似結果。Filser⁽⁴⁹⁾則以藥物

（中位數為 280 pmol/g Hb）比非抽煙者（中位數為 50 pmol/g Hb）高 5 倍以上。Törnqvist(1992)⁽⁴²⁾針對雙胞胎的研究中指出抽煙量與 HEV 生成量有明顯相關。Ehrenberg(1995)⁽⁴⁸⁾則表示一般人體內 HEV 的背 景值約 20 pmol/g Hb，在動物實驗也得到相似結果。Filser⁽⁴⁹⁾則以藥物